HSV-1SM44株糖蛋白D基因真核表达载体的构建及其免疫效果观察
HSV-1SM44株糖蛋白D基因真核表达载体的构建及其免疫效果观察
余颖 马文煜 杨乔欣
摘 要：目的 构建HSV-1型SM44株糖蛋白D(gD)基因的真核表达载体，并用此重组质粒直接免疫小鼠，探讨HSV-1gD基因作为基因疫苗的可能性。方法 从HSV-1基因组中扩增gD的全编码基因，克隆入载体pUC19中，测序鉴定后转入真核表达载体pcDNA3.1(+)。所得重组质粒pcDNA-gD以电穿孔法转染CHO细胞，并以荧光染色法鉴定表达效果。用pcDNA-gD免疫小鼠，ELISA法检测基因免疫的应答效果。结果 成功地构建了可在真核细胞中有效表达的HSV-1gD真核表达载体，用其直接免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答。结论 gD的真核表达载体有可能作为HSV-1的基因疫苗，为进一步研究基于gD的表位生物学和表位疫苗奠定了基础。
, http://www.100md.com
关键词:单纯疱疹病毒1型；糖蛋白D；真核表达；基因免疫
单纯疱疹病毒(HSV)是引起包括口唇疱疹、疱疹性脑炎、疱疹性角膜炎和生殖器疱疹等疾病的病原体，目前尚无有效的疫苗。已发现的HSV囊膜糖蛋白有11种，它们在病毒的吸附、膜融合、穿入和扩散等方面起着重要的作用。其中几种糖蛋白可诱发产生高滴度的抗体及细胞免疫应答，是HSV的重要保护性抗原[1]。目前已知，HSV-1和HSV-2的型共同性糖蛋白D(gD)在针对HSV的保护性免疫中起着主要的作用，是HSV亚单位疫苗的首选抗原之一[2]。为探讨HSV-1gD基因作为HSV基因疫苗的可能性，我们将HSV-1gD全长基因片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1中，观察了其核酸的免疫效果，为进一步研究gD的表位生物学奠定了基础。
1材料和方法
1.1材料HSV-1SM44株购自卫生部生物制品鉴定所。CHO细胞系及BHK21-C13细胞系由本室保存。质粒pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司。抗HSVgD-1的型特异性mAbDL2为美国宾西法尼亚大学Cohen教授惠赠。异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠抗体购自华美生物工程公司。限制性内切酶、T4DNA连接酶购自华美生物工程公司。蛋白酶K为日本Takara公司产品。PCRPurekit为Clonetech公司产品，WizardPlusMaxiprepsDNAPurificationSystem购自Promega公司。
, http://www.100md.com
1.2方法
1.2.1gD基因的扩增 根据已报道的HSV-1Patton株的基因序列，设计合成一对针对gD基因序列的特异引物，分别含有BamHI和EcoRI酶切位点。上游引物P1:5′-GTGGATCCTTTTGTGTGGTGCGTTCCG-3′；下游引物P2：5′-GTGGTCGGGAACAAAATGATCACTCTTAAGGA-3′。常规提取HSV-1SM44株感染的BHK细胞基因组DNA。以细胞裂解液(NP-400.45mL/L，Tween-200.45mL/L，蛋白酶K200mg/L,10×PCRbuffer10mL/L)裂解感染的细胞，经酚、氯仿抽提、乙醇沉淀、干燥后，超纯水溶解，作为PCR模板。PCR反应体系的组成：模板2μL，引物各50pmol/L，2.5mmol/LdNTPs8μL，15mmol/LMg2+6μL，10×PCRbuffer10μL及Taq酶3U。反应条件为：94℃1min，55℃1.5min,72℃1.5min，共经30个循环。PCR产物经1.2%agarose凝胶电泳鉴定。
, http://www.100md.com
1.2.2重组克隆载体的构建 上述PCR产物经BamHI和EcoRI双酶切，回收后克隆入pUC19中。具体操作见《CurrentProtocolsinMolecularBiology》[3]有关章节。所得重组质粒经双酶切鉴定及全自动荧光测序仪正反向测序鉴定后，命名为pUC-gD.采用FASTA软件查询测序结果，验证所克隆的基因序列的正确性。
1.2.3真核表达载体构建 将重组质粒pUC-gD用BamHI和EcoRI双酶切后，所获纯化片段重组入真核表达载体pcDNA3.1中，得到重组质粒pcDNA-gD。具体操作见《CurrentProtocolsinMolecularBiology》[3]有关章节。
1.2.4转染CHO细胞 以15%DMEM培养CHO细胞两瓶至铺满瓶底70%，用胰酶消化后吹下，重悬于800μL低压穿孔液中。取质粒pcDNA-gD和pcDNA3.1各400μL，分别与等量细胞悬液混合后，移入两个穿孔杯中，通过低压电穿孔转染CHO细胞。电穿孔仪为Bio-RadGENEPULSERⅡ，设定电压为230V，电容为950μF。电穿后，将细胞转入6孔板培养(内置盖玻片)。24h后换液，48h后取出玻片，用15mL/L冷丙酮固定、荧光染色(一抗为抗gD1mAbDL2,二抗为异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠抗体)后，于荧光显微镜(OlympusPM-30)下观察并照相。
, 百拇医药
1.2.5基因免疫 大量提取质粒pcDNA-gD及pcDNA3.1，使其终浓度均为1g/L。取6wk龄雌性Balb/c小鼠12只,随机分为3组，每组各4只。于两侧股四头肌各注射5%布比卡因10μL，12～24h后，再于同一部位分别注射pcDNA-gD、空载体pcDNA3.1及生理盐水各100μL,共免疫4次，每次间隔2周。末次免疫1周后，尾静脉取血、离心、取上清。以HSV-1膜抗原包被做ELISA检测特异性抗体。
2结果
2.1gD基因的PCR扩增 以HSV-1SM44株感染细胞的基因组DNA为模板，进行PCR扩增gD基因。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，观察所得片段的大小约为1.2kb，同预期片段的大小相符合(图1)。
, http://www.100md.com
图1HSV-1gD基因的PCR扩增
Fig1 PCR amplification of HSV-1gDgene
1:PCR marker(1543,994,695,515,377bp from top to bottom);
2:HSV-1gD gene.
2.2pUC-gD的构建和测序 为进一步鉴定所得gD序列的正确性，将其克隆入pUC19中。测序及查询结果表明，所克隆的基因与其它多株HSV-1gD的序列高度同源，与HSV-117+株gD序列的同源性达98.84%，不同之处多集中于信号肽编码区，证实了所克隆基因序列的真实性。
2.3gD真核表达载体的构建 将gD基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，以连接产物转化JM109后，挑取4个菌落提取质粒，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定，其中有2个质粒切下了1.2kb的片段，将此阳性克隆命名为pcDNA-gD(图2)。
, http://www.100md.com
图2重组质粒pcDNA-gD的酶切鉴定
Fig2 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid
pcDNA-gD
1:λDNA/Hind Ⅲ marker;2,4:Plasmid gene;
3,5:Plasmid pcDNA fragment and inserted gene;6:PCR marker.
2.4gD的真核细胞表达 以pcDNA-gD转染CHO细胞，同时以空载体pcDNA3.1转染CHO细胞作为对照。48h后，取出细胞做爬片，经荧光染色后观察(图3)可见：转染了pcDNA-gD的细胞表达的外源蛋白gD可与一抗(抗gD的mAbDL2)结合，后者再与荧光二抗(异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠抗体)结合，呈现出明显的黄绿色荧光。对照(空载体组转染细胞)因没有gD，无法与一抗以及荧光二抗相结合而出现阴性反应，呈暗红色。
, http://www.100md.com
图3pcDNA-gD和pcDNA3.1转染细胞的荧光染色
Fig3 Fluorescent staining of CHO cells transfected respectively with pcDNA-gD and pcDNA3.1(+)(×400)
1:CHO cells transfected with pcDNA-gD;2:CHO cells transfected with pcDNA3.1(+).
2.5pcDNA-gD的基因免疫 用ELISA法检测表明，pcDNA-gD免疫组4只小鼠呈阳性，血清A460nm值为0.22±0.02。空载体对照组及空白对照组小鼠血清A460nm值分别为0.08±0.01和0.01，经卡方t检验P∨0.01,可认为这两组没有产生特异性抗体。
3讨论
, 百拇医药
HSV属于有囊膜的双链DNA病毒。尽管多年来人们为预防HSV的感染做了很多工作，但由于其基因组中可能带有癌基因，为防止整合到宿主基因组中的HSV基因在体内被各种因素激活，故HSV全病毒疫苗至今未能应用于人。HSV-1的囊膜糖蛋白D(gD)可诱导机体产生高滴度的型共同性中和抗体，通过CDC和ADCC作用，可使gD免疫小鼠免受HSV的致死性攻击。因此，近年来针对HSV疫苗研究的焦点，都集中于gD亚单位或基因工程疫苗上，并取得了一些成功。Straus等[4]以克隆表达的HSV-2gD抗原加氢氧化铝对生殖道疱疹患者进行临床双盲治疗试验，证明可改变临床病程。但重组蛋白质疫苗与天然抗原相比较，还存在一些不足，除成本较为昂贵外，主要是蛋白质经体外折叠、修饰后减弱了其免疫效果。而核酸疫苗则能模拟病毒自然感染过程中抗原提呈的过程，使表达的抗原能以天然的形式加工提呈给免疫识别系统，从而有效地诱生保护性免疫反应[5]。这就是核酸疫苗相对于重组蛋白疫苗的优越之处，也正是其近年来成为传染病防治研究热点的原因之一。
, http://www.100md.com
gD基因全长为1182bp，目前已探明其中含有辅助性T细胞表位和B细胞表位，因此，极有可能也存在着CTL表位。Zhiya等[6]用已克隆的编码HSV-1gD前23个氨基酸的基因(含B细胞表位)和含其它蛋白两个CTL表位基因的pcDNA3.1质粒免疫小鼠，获得了较好的免疫效果。而对于gD所含表位的进一步分析还在进行中[7]。
本文中，我们将HSV-1SM44株gD基因的真核表达载体在真核细胞中进行了有效表达，免疫小鼠后可诱发较高水平的特异性抗体应答，说明gD中含有较强的B细胞表位。但其能否诱发机体高保护活性的细胞免疫应答尚需进一步的鉴定。本研究结果提示，真核表达载体可用于表达HSV-1的特定糖蛋白，为研制HSV基因疫苗提供了可能，并为进一步研究基于gD的表位生物学和表位疫苗的研究奠定了基础。
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39770040
, 百拇医药
作者简介：余颖，女，26岁，硕士生
余颖(第四军医大学基础部微生物学教研室,陕西 西安 710032)
马文煜(第四军医大学基础部微生物学教研室,陕西 西安 710032)
杨乔欣(第四军医大学基础部微生物学教研室,陕西 西安 710032)
参考文献:
[1]Rajcani J,Vojvodova A.The role of herpes simplex virus glycoproteins in the virus replication cycle[J].Acta Virol,1998;42(2):103-118.
[2]Stanberry LR,Bernstein DI,Burke RL,et al.Vaccination with recombinant herpes simplex virus glycoproteins.Protection against initial and recurrent genital herpes[J].J Infect Dis,1987;155:914-920.
, 百拇医药
[3]Ausubel F,Brent R,Kingston RE,et al.Current protocols in molecular biology[M].John Wiley ＆ Sons Inc.1996:Volume 1.3.0.3-3.17.3.
[4]Straus SE,Corey L,Burke RL,et al.Placebo controlled trial of vaccination with recombinant glycoprotein D of HSV-2 for immunotherapy of genital herpes[J].Lancet,1994;343:1460-1463.
[5]吴青.基因免疫[J].生命的化学，1997;17(3):50-52.
[6]Yu Z,Karem KL,Kanangat S,et al.Protection by minigenes:a novel approach of DNA vaccines[J].Vaccine,1998;16(17):1660-1667.
[7]Bernstein DI,Stanberry LR.Herpes simplex virus vaccines[J].Vaccine,1999;17:1681-1689., 百拇医药
余颖 马文煜 杨乔欣
摘 要：目的 构建HSV-1型SM44株糖蛋白D(gD)基因的真核表达载体，并用此重组质粒直接免疫小鼠，探讨HSV-1gD基因作为基因疫苗的可能性。方法 从HSV-1基因组中扩增gD的全编码基因，克隆入载体pUC19中，测序鉴定后转入真核表达载体pcDNA3.1(+)。所得重组质粒pcDNA-gD以电穿孔法转染CHO细胞，并以荧光染色法鉴定表达效果。用pcDNA-gD免疫小鼠，ELISA法检测基因免疫的应答效果。结果 成功地构建了可在真核细胞中有效表达的HSV-1gD真核表达载体，用其直接免疫小鼠可引起较高水平的特异性抗体应答。结论 gD的真核表达载体有可能作为HSV-1的基因疫苗，为进一步研究基于gD的表位生物学和表位疫苗奠定了基础。
, http://www.100md.com
关键词:单纯疱疹病毒1型；糖蛋白D；真核表达；基因免疫
单纯疱疹病毒(HSV)是引起包括口唇疱疹、疱疹性脑炎、疱疹性角膜炎和生殖器疱疹等疾病的病原体，目前尚无有效的疫苗。已发现的HSV囊膜糖蛋白有11种，它们在病毒的吸附、膜融合、穿入和扩散等方面起着重要的作用。其中几种糖蛋白可诱发产生高滴度的抗体及细胞免疫应答，是HSV的重要保护性抗原[1]。目前已知，HSV-1和HSV-2的型共同性糖蛋白D(gD)在针对HSV的保护性免疫中起着主要的作用，是HSV亚单位疫苗的首选抗原之一[2]。为探讨HSV-1gD基因作为HSV基因疫苗的可能性，我们将HSV-1gD全长基因片段克隆入真核表达载体pcDNA3.1中，观察了其核酸的免疫效果，为进一步研究gD的表位生物学奠定了基础。
1材料和方法
1.1材料HSV-1SM44株购自卫生部生物制品鉴定所。CHO细胞系及BHK21-C13细胞系由本室保存。质粒pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司。抗HSVgD-1的型特异性mAbDL2为美国宾西法尼亚大学Cohen教授惠赠。异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠抗体购自华美生物工程公司。限制性内切酶、T4DNA连接酶购自华美生物工程公司。蛋白酶K为日本Takara公司产品。PCRPurekit为Clonetech公司产品，WizardPlusMaxiprepsDNAPurificationSystem购自Promega公司。
, http://www.100md.com
1.2方法
1.2.1gD基因的扩增 根据已报道的HSV-1Patton株的基因序列，设计合成一对针对gD基因序列的特异引物，分别含有BamHI和EcoRI酶切位点。上游引物P1:5′-GTGGATCCTTTTGTGTGGTGCGTTCCG-3′；下游引物P2：5′-GTGGTCGGGAACAAAATGATCACTCTTAAGGA-3′。常规提取HSV-1SM44株感染的BHK细胞基因组DNA。以细胞裂解液(NP-400.45mL/L，Tween-200.45mL/L，蛋白酶K200mg/L,10×PCRbuffer10mL/L)裂解感染的细胞，经酚、氯仿抽提、乙醇沉淀、干燥后，超纯水溶解，作为PCR模板。PCR反应体系的组成：模板2μL，引物各50pmol/L，2.5mmol/LdNTPs8μL，15mmol/LMg2+6μL，10×PCRbuffer10μL及Taq酶3U。反应条件为：94℃1min，55℃1.5min,72℃1.5min，共经30个循环。PCR产物经1.2%agarose凝胶电泳鉴定。
, http://www.100md.com
1.2.2重组克隆载体的构建 上述PCR产物经BamHI和EcoRI双酶切，回收后克隆入pUC19中。具体操作见《CurrentProtocolsinMolecularBiology》[3]有关章节。所得重组质粒经双酶切鉴定及全自动荧光测序仪正反向测序鉴定后，命名为pUC-gD.采用FASTA软件查询测序结果，验证所克隆的基因序列的正确性。
1.2.3真核表达载体构建 将重组质粒pUC-gD用BamHI和EcoRI双酶切后，所获纯化片段重组入真核表达载体pcDNA3.1中，得到重组质粒pcDNA-gD。具体操作见《CurrentProtocolsinMolecularBiology》[3]有关章节。
1.2.4转染CHO细胞 以15%DMEM培养CHO细胞两瓶至铺满瓶底70%，用胰酶消化后吹下，重悬于800μL低压穿孔液中。取质粒pcDNA-gD和pcDNA3.1各400μL，分别与等量细胞悬液混合后，移入两个穿孔杯中，通过低压电穿孔转染CHO细胞。电穿孔仪为Bio-RadGENEPULSERⅡ，设定电压为230V，电容为950μF。电穿后，将细胞转入6孔板培养(内置盖玻片)。24h后换液，48h后取出玻片，用15mL/L冷丙酮固定、荧光染色(一抗为抗gD1mAbDL2,二抗为异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠抗体)后，于荧光显微镜(OlympusPM-30)下观察并照相。
, 百拇医药
1.2.5基因免疫 大量提取质粒pcDNA-gD及pcDNA3.1，使其终浓度均为1g/L。取6wk龄雌性Balb/c小鼠12只,随机分为3组，每组各4只。于两侧股四头肌各注射5%布比卡因10μL，12～24h后，再于同一部位分别注射pcDNA-gD、空载体pcDNA3.1及生理盐水各100μL,共免疫4次，每次间隔2周。末次免疫1周后，尾静脉取血、离心、取上清。以HSV-1膜抗原包被做ELISA检测特异性抗体。
2结果
2.1gD基因的PCR扩增 以HSV-1SM44株感染细胞的基因组DNA为模板，进行PCR扩增gD基因。扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后，观察所得片段的大小约为1.2kb，同预期片段的大小相符合(图1)。
, http://www.100md.com
图1HSV-1gD基因的PCR扩增
Fig1 PCR amplification of HSV-1gDgene
1:PCR marker(1543,994,695,515,377bp from top to bottom);
2:HSV-1gD gene.
2.2pUC-gD的构建和测序 为进一步鉴定所得gD序列的正确性，将其克隆入pUC19中。测序及查询结果表明，所克隆的基因与其它多株HSV-1gD的序列高度同源，与HSV-117+株gD序列的同源性达98.84%，不同之处多集中于信号肽编码区，证实了所克隆基因序列的真实性。
2.3gD真核表达载体的构建 将gD基因克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，以连接产物转化JM109后，挑取4个菌落提取质粒，用BamHI和EcoRI双酶切鉴定，其中有2个质粒切下了1.2kb的片段，将此阳性克隆命名为pcDNA-gD(图2)。
, http://www.100md.com
图2重组质粒pcDNA-gD的酶切鉴定
Fig2 Restriction enzyme analysis of recombinant plasmid
pcDNA-gD
1:λDNA/Hind Ⅲ marker;2,4:Plasmid gene;
3,5:Plasmid pcDNA fragment and inserted gene;6:PCR marker.
2.4gD的真核细胞表达 以pcDNA-gD转染CHO细胞，同时以空载体pcDNA3.1转染CHO细胞作为对照。48h后，取出细胞做爬片，经荧光染色后观察(图3)可见：转染了pcDNA-gD的细胞表达的外源蛋白gD可与一抗(抗gD的mAbDL2)结合，后者再与荧光二抗(异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠抗体)结合，呈现出明显的黄绿色荧光。对照(空载体组转染细胞)因没有gD，无法与一抗以及荧光二抗相结合而出现阴性反应，呈暗红色。
, http://www.100md.com
图3pcDNA-gD和pcDNA3.1转染细胞的荧光染色
Fig3 Fluorescent staining of CHO cells transfected respectively with pcDNA-gD and pcDNA3.1(+)(×400)
1:CHO cells transfected with pcDNA-gD;2:CHO cells transfected with pcDNA3.1(+).
2.5pcDNA-gD的基因免疫 用ELISA法检测表明，pcDNA-gD免疫组4只小鼠呈阳性，血清A460nm值为0.22±0.02。空载体对照组及空白对照组小鼠血清A460nm值分别为0.08±0.01和0.01，经卡方t检验P∨0.01,可认为这两组没有产生特异性抗体。
3讨论
, 百拇医药
HSV属于有囊膜的双链DNA病毒。尽管多年来人们为预防HSV的感染做了很多工作，但由于其基因组中可能带有癌基因，为防止整合到宿主基因组中的HSV基因在体内被各种因素激活，故HSV全病毒疫苗至今未能应用于人。HSV-1的囊膜糖蛋白D(gD)可诱导机体产生高滴度的型共同性中和抗体，通过CDC和ADCC作用，可使gD免疫小鼠免受HSV的致死性攻击。因此，近年来针对HSV疫苗研究的焦点，都集中于gD亚单位或基因工程疫苗上，并取得了一些成功。Straus等[4]以克隆表达的HSV-2gD抗原加氢氧化铝对生殖道疱疹患者进行临床双盲治疗试验，证明可改变临床病程。但重组蛋白质疫苗与天然抗原相比较，还存在一些不足，除成本较为昂贵外，主要是蛋白质经体外折叠、修饰后减弱了其免疫效果。而核酸疫苗则能模拟病毒自然感染过程中抗原提呈的过程，使表达的抗原能以天然的形式加工提呈给免疫识别系统，从而有效地诱生保护性免疫反应[5]。这就是核酸疫苗相对于重组蛋白疫苗的优越之处，也正是其近年来成为传染病防治研究热点的原因之一。
, http://www.100md.com
gD基因全长为1182bp，目前已探明其中含有辅助性T细胞表位和B细胞表位，因此，极有可能也存在着CTL表位。Zhiya等[6]用已克隆的编码HSV-1gD前23个氨基酸的基因(含B细胞表位)和含其它蛋白两个CTL表位基因的pcDNA3.1质粒免疫小鼠，获得了较好的免疫效果。而对于gD所含表位的进一步分析还在进行中[7]。
本文中，我们将HSV-1SM44株gD基因的真核表达载体在真核细胞中进行了有效表达，免疫小鼠后可诱发较高水平的特异性抗体应答，说明gD中含有较强的B细胞表位。但其能否诱发机体高保护活性的细胞免疫应答尚需进一步的鉴定。本研究结果提示，真核表达载体可用于表达HSV-1的特定糖蛋白，为研制HSV基因疫苗提供了可能，并为进一步研究基于gD的表位生物学和表位疫苗的研究奠定了基础。
基金项目：国家自然科学基金资助，No.39770040
, 百拇医药
作者简介：余颖，女，26岁，硕士生
余颖(第四军医大学基础部微生物学教研室,陕西 西安 710032)
马文煜(第四军医大学基础部微生物学教研室,陕西 西安 710032)
杨乔欣(第四军医大学基础部微生物学教研室,陕西 西安 710032)
参考文献:
[1]Rajcani J,Vojvodova A.The role of herpes simplex virus glycoproteins in the virus replication cycle[J].Acta Virol,1998;42(2):103-118.
[2]Stanberry LR,Bernstein DI,Burke RL,et al.Vaccination with recombinant herpes simplex virus glycoproteins.Protection against initial and recurrent genital herpes[J].J Infect Dis,1987;155:914-920.
, 百拇医药
[3]Ausubel F,Brent R,Kingston RE,et al.Current protocols in molecular biology[M].John Wiley ＆ Sons Inc.1996:Volume 1.3.0.3-3.17.3.
[4]Straus SE,Corey L,Burke RL,et al.Placebo controlled trial of vaccination with recombinant glycoprotein D of HSV-2 for immunotherapy of genital herpes[J].Lancet,1994;343:1460-1463.
[5]吴青.基因免疫[J].生命的化学，1997;17(3):50-52.
[6]Yu Z,Karem KL,Kanangat S,et al.Protection by minigenes:a novel approach of DNA vaccines[J].Vaccine,1998;16(17):1660-1667.
[7]Bernstein DI,Stanberry LR.Herpes simplex virus vaccines[J].Vaccine,1999;17:1681-1689., 百拇医药