高压氧对减压病大鼠肺组织自由基的影响
高压氧对减压病大鼠肺组织自由基的影响
朱祥祺 倪大智 李慈 陈士明 严小敏
摘 要 目的 评价高压氧治疗对快速减压自由基增加的抑制作用。方法 SD大鼠经600 kPa压缩空气暴露后，分别用1 min作快速减压或83 min作缓慢减压。减至常压后第20 min，快速减压的动物分别给以常压纯氧(PO2≥95 kPa)或高压氧(PO2≥285 kPa)治疗30 min，第90min时所有动物处死并取肺作匀浆。用电子顺磁共振技术测定肺匀浆液的自由基强度；用化学法测定超氧化物歧化酶活性、维生素C及丙二醛(MDA)含量。结果 快速减压后肺组织自由基强度、MDA含量明显增加(P<0.05)。常压氧和高压氧作用后这些指标都达到对照水平。常压纯氧对维生素C无明显影响，高压氧使维生素C含量高于对照水平。结论 常压纯氧和高压氧对快速减压后自由基增殖有明显抑制作用，高压氧的作用大于常压氧。
, 百拇医药
关键词：高压氧；减压病；超氧化物歧化酶；丙二醛；自由基
体内氧自由基(OR)的生成和对生物体系的毒害作用已有大量报道[1]。我们用电子顺磁共振(EPR)技术证实，在高压氧暴露后快速减压的大鼠肺组织OR生成明显增加。而HBO对减压病(DCS)时的OR生成有何影响尚不清楚。本实验将通过大鼠发生DCS后进行HBO治疗，观察其肺内氧化胁迫(OS)的变化，来评价HBO对OS的作用。
材料和方法
雄性Sprigue Dawly大鼠104只，购自上海计划生育研究所。56只用于OR的EPR检验，体重为190～230 g,平均(207.2±13.1)g,按体重随机分为6组：快速减压组(1组)及其对照组(C1组)；快速减压后吸常压纯氧组(2组，PO2≥95 kPa)、快速减压后HBO治疗组(3组，PO2≥285 kPa)、缓慢减压组(4组)以及2，3，4组的对照组(C2组)；48只供生化测试用，体重为190～260 g，平均(232，0±13.9)g，按体重随机分为5组：1，2，3，4组(意义同上)，以及他们的对照组(C3组)。各对照组动物数每组8只，各处理组动物数每组10只。
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采用0.05 m3的加压舱，舱内铺以新鲜钠石灰。各处理组动物分批放入加压舱，用压缩空气在1 min内加压至600 kPa abs，高压下停留60 min，1，2和3组用1 min减至常压。第4组用阶段减压法缓慢减压，总减压时间83 min。在高压停留期间，每15 min用压缩空气通风1次。减至常压后20 min开始，2组和3组动物分别进入高压氧舱(0.05 m3)呼吸常压纯氧或HBO 30 min，然后用10 min匀速减至常压。高气压停留期间每15 min用纯氧通风1次，对照组呼吸常压空气。
样品制备：各处理组在减压后60 min时，腹腔注入0.08 mol/L的自由基捕捉剂四特丁氮酮(N-t-Butyl-α-Phenylnitrone,PBN,Sigma Co),0.5 ml/100 g；90 min时腹腔注入20%urethane 0.5 ml/100 g。麻醉后腹主动脉放血处死，取肺0.75 g，在玻璃匀浆管内和1 ml(供EPR测定)或4 ml(供生化测定)冷生理盐水一起充分匀浆，800 g离心15 min，弃去沉淀备用。
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自由基检测：样品注入60 μl的扁平玻璃管，在复旦大学测试中心用电子顺磁共振波谱仪(ER200D-SRC，德国产)测定OR信号。OR强度用相对强度(RI)表示：RI＝峰值×(线宽)2。
生化指标测定：用TBA法测定肺匀浆液中丙二醛(MDA)含量；Fe3+还原法测定维生素CAA浓度；Xan-Xan氧化酶系统测定超氧化物歧化酶(SOD)活性。试剂都是南京建成生物工程研究所提供的测定试剂盒。数据用团体t检验处理。
结果
减压效果：对照组和缓慢减压组的动物表现安静，自动挤成一堆。快速减压的各组动物，约10～15 min才开始挤成一堆。第2组减压后有1只死亡，2只处于濒死状态(呼吸浅快，昏迷状)，后在吸氧期间死亡，第3组在减压后有1只死亡，2只处于濒死状态，于HBO处理后，其中1只基本恢复，另一只仍昏迷但未死亡。
, 百拇医药
OR强度：EPR波谱显示等高双峰波型，g＝2.005 4，aH＝1.8 G(图略)，为典型的维生素C 自由基特征波谱。第1组动物的RI值明显高于相应的对照组(t＝2.17，Q<0.05)；而快速减压后接受HBO治疗的动物RI值明显低于对照组。各组RI值见表1。
生化测定：第1组SOD活性明显低于对照组(t＝6.2，P<0.05)，MDA含量明显高于对照组(t＝2.88，P<0.05)，而维生素C含量无改变。第2组的SOD活性，维生素C和MDA含量与对照组相比差异无显著性。第3组SOD和MDA与对照组差异无显著性，但维生素C含量高于对照组(t＝2.13，P<0.05)。各指标测试结果见表2。
表1 不同条件下大鼠肺组织自由基强度(RI，X±s)
组别
鼠数(只)
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自由基强度
C1
5
241.2±44.3
1
9
312.3±64.8
C2
7
332.3±48.8
2
5
349.2±70.4
, 百拇医药
3
7
263.6±55.7
4
8
336.8±68.1
表2 肺SOD活性，AA(μg/kg)和MDA(nmol/kg)含量(X±s)
组别
鼠数(只)
SOD
AA
MDA
, 百拇医药
C3
8
10.7±0.9
95.7±41.2
62.9±16.4
1
7
6.4±1.7
85.1±57.3
82.6± 8.0
2
7
9.1±1.2
, 百拇医药
106.7±36.2
66.9± 9.4
3
10
10.1±1.1
134.1±35.2
67.8± 4.0
4
10
8.6±2.4
79.0±48.0
63.3± 8.8
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讨论 本实验中，因快速减压造成4只动物死亡，在取肺时又发现17只鼠有较严重的局灶性肺炎。由于舍弃这21只动物，实际用来检测的样本数为83只。
OR的探测方法有多种。EPR技术属于直接测定方法的一种，它能反应自由基的性质及生成和消退的动力学特征[2]，因而在化学和物理学中研究自由基代谢，是最常用的一种方法。另一种方法是通过探测内源性氧化产物和抗氧化剂的变化对自由基作出评价[3]。本实验的EPR检测结果显示，快速减压后90 min时，肺组织内OR生成增加，与此相对应，生化测定显示此时动物体内SOD活性降低，MDA含量升高。这说明，减压病可引起体内自由基增加，并对机体造成一定程度的损伤。根据DCS的发病机理知道，高压氧暴露后的快速减压使机体产生大量气泡，这些气泡最后集中于肺，引起肺循环栓塞、血流瘀滞以及白细胞聚集并激活[4]。这些都可引起肺内自由基生成增加。
HBO已广泛用于临床上多种疾病的治疗，同时也是治疗DCS的重要措施[5]。本实验进一步观察到，HBO明显抑制快速减压后OR的增生，同时也使SOD和MDA回复到对照水平，说明HBO通过减少OR的生成和加强对OR的清除起到抗氧化作用，减轻DCS时OS程度，防止或减轻组织损伤，常压纯氧也有类似作用，提示在不具备高压氧设备的情况下，为减轻OR对机体的损伤，也可考虑采用常压纯氧来代替。
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维生素C是体内最有效的水溶性抗氧化剂[6]，它还原OR的同时自身变成维生素C自由基，其中一部分经谷胱甘肽变为还原型维生素C，另一部分经古洛糖酸途径代谢排出体外。所以维生素C的抗氧化过程是自身消耗过程。本实险中未发现维生素C含量随OR增加而减少。这是一个矛盾现象，有待今后作进一步探讨。
作者单位：朱祥祺(200433 上海，海军医学研究所)
倪大智(200433 上海，海军医学研究所)
李慈(200433 上海，海军医学研究所)
陈士明(复旦大学测试中心)
严小敏(复旦大学测试中心)
参考文献
, 百拇医药
1，Gutteridge JM.Biological origin of free radicals,and mechanisms of antioxidant protection.Chem Biol interact,1990,91:113-140.
2，Coghlan JG,Flitter W,Holley AE,et al.Detection of free radicals and cholesterol hydroperoxides of in blood taken from the coronary sinus of man during percutaneous transluminal coronary angioplasty.Free Rad Res Comm,1991,14:409-417.
3，Smith CV.Correlation and apparent contradictions in assessment of oxidant stress status in vivo.Free Rad Biol Med,1991,10:217-220.
4，Anderson JC,Bennett PB.Hematologic change caused by deep trimix diving.The Atlantis IVexperience.Undersea Biomed Res,1981,8:43.
5，Workman RH.Treatment of bends with oxygen at high pressure.Aerospace Med,1968,39:1076-1085.
6，Niki E.Vitamin C as antioxidant.World Rev Nutr Diet，1991,64:1-30., 百拇医药
朱祥祺 倪大智 李慈 陈士明 严小敏
摘 要 目的 评价高压氧治疗对快速减压自由基增加的抑制作用。方法 SD大鼠经600 kPa压缩空气暴露后，分别用1 min作快速减压或83 min作缓慢减压。减至常压后第20 min，快速减压的动物分别给以常压纯氧(PO2≥95 kPa)或高压氧(PO2≥285 kPa)治疗30 min，第90min时所有动物处死并取肺作匀浆。用电子顺磁共振技术测定肺匀浆液的自由基强度；用化学法测定超氧化物歧化酶活性、维生素C及丙二醛(MDA)含量。结果 快速减压后肺组织自由基强度、MDA含量明显增加(P<0.05)。常压氧和高压氧作用后这些指标都达到对照水平。常压纯氧对维生素C无明显影响，高压氧使维生素C含量高于对照水平。结论 常压纯氧和高压氧对快速减压后自由基增殖有明显抑制作用，高压氧的作用大于常压氧。
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关键词：高压氧；减压病；超氧化物歧化酶；丙二醛；自由基
体内氧自由基(OR)的生成和对生物体系的毒害作用已有大量报道[1]。我们用电子顺磁共振(EPR)技术证实，在高压氧暴露后快速减压的大鼠肺组织OR生成明显增加。而HBO对减压病(DCS)时的OR生成有何影响尚不清楚。本实验将通过大鼠发生DCS后进行HBO治疗，观察其肺内氧化胁迫(OS)的变化，来评价HBO对OS的作用。
材料和方法
雄性Sprigue Dawly大鼠104只，购自上海计划生育研究所。56只用于OR的EPR检验，体重为190～230 g,平均(207.2±13.1)g,按体重随机分为6组：快速减压组(1组)及其对照组(C1组)；快速减压后吸常压纯氧组(2组，PO2≥95 kPa)、快速减压后HBO治疗组(3组，PO2≥285 kPa)、缓慢减压组(4组)以及2，3，4组的对照组(C2组)；48只供生化测试用，体重为190～260 g，平均(232，0±13.9)g，按体重随机分为5组：1，2，3，4组(意义同上)，以及他们的对照组(C3组)。各对照组动物数每组8只，各处理组动物数每组10只。
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采用0.05 m3的加压舱，舱内铺以新鲜钠石灰。各处理组动物分批放入加压舱，用压缩空气在1 min内加压至600 kPa abs，高压下停留60 min，1，2和3组用1 min减至常压。第4组用阶段减压法缓慢减压，总减压时间83 min。在高压停留期间，每15 min用压缩空气通风1次。减至常压后20 min开始，2组和3组动物分别进入高压氧舱(0.05 m3)呼吸常压纯氧或HBO 30 min，然后用10 min匀速减至常压。高气压停留期间每15 min用纯氧通风1次，对照组呼吸常压空气。
样品制备：各处理组在减压后60 min时，腹腔注入0.08 mol/L的自由基捕捉剂四特丁氮酮(N-t-Butyl-α-Phenylnitrone,PBN,Sigma Co),0.5 ml/100 g；90 min时腹腔注入20%urethane 0.5 ml/100 g。麻醉后腹主动脉放血处死，取肺0.75 g，在玻璃匀浆管内和1 ml(供EPR测定)或4 ml(供生化测定)冷生理盐水一起充分匀浆，800 g离心15 min，弃去沉淀备用。
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自由基检测：样品注入60 μl的扁平玻璃管，在复旦大学测试中心用电子顺磁共振波谱仪(ER200D-SRC，德国产)测定OR信号。OR强度用相对强度(RI)表示：RI＝峰值×(线宽)2。
生化指标测定：用TBA法测定肺匀浆液中丙二醛(MDA)含量；Fe3+还原法测定维生素CAA浓度；Xan-Xan氧化酶系统测定超氧化物歧化酶(SOD)活性。试剂都是南京建成生物工程研究所提供的测定试剂盒。数据用团体t检验处理。
结果
减压效果：对照组和缓慢减压组的动物表现安静，自动挤成一堆。快速减压的各组动物，约10～15 min才开始挤成一堆。第2组减压后有1只死亡，2只处于濒死状态(呼吸浅快，昏迷状)，后在吸氧期间死亡，第3组在减压后有1只死亡，2只处于濒死状态，于HBO处理后，其中1只基本恢复，另一只仍昏迷但未死亡。
, 百拇医药
OR强度：EPR波谱显示等高双峰波型，g＝2.005 4，aH＝1.8 G(图略)，为典型的维生素C 自由基特征波谱。第1组动物的RI值明显高于相应的对照组(t＝2.17，Q<0.05)；而快速减压后接受HBO治疗的动物RI值明显低于对照组。各组RI值见表1。
生化测定：第1组SOD活性明显低于对照组(t＝6.2，P<0.05)，MDA含量明显高于对照组(t＝2.88，P<0.05)，而维生素C含量无改变。第2组的SOD活性，维生素C和MDA含量与对照组相比差异无显著性。第3组SOD和MDA与对照组差异无显著性，但维生素C含量高于对照组(t＝2.13，P<0.05)。各指标测试结果见表2。
表1 不同条件下大鼠肺组织自由基强度(RI，X±s)
组别
鼠数(只)
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自由基强度
C1
5
241.2±44.3
1
9
312.3±64.8
C2
7
332.3±48.8
2
5
349.2±70.4
, 百拇医药
3
7
263.6±55.7
4
8
336.8±68.1
表2 肺SOD活性，AA(μg/kg)和MDA(nmol/kg)含量(X±s)
组别
鼠数(只)
SOD
AA
MDA
, 百拇医药
C3
8
10.7±0.9
95.7±41.2
62.9±16.4
1
7
6.4±1.7
85.1±57.3
82.6± 8.0
2
7
9.1±1.2
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106.7±36.2
66.9± 9.4
3
10
10.1±1.1
134.1±35.2
67.8± 4.0
4
10
8.6±2.4
79.0±48.0
63.3± 8.8
, http://www.100md.com
讨论 本实验中，因快速减压造成4只动物死亡，在取肺时又发现17只鼠有较严重的局灶性肺炎。由于舍弃这21只动物，实际用来检测的样本数为83只。
OR的探测方法有多种。EPR技术属于直接测定方法的一种，它能反应自由基的性质及生成和消退的动力学特征[2]，因而在化学和物理学中研究自由基代谢，是最常用的一种方法。另一种方法是通过探测内源性氧化产物和抗氧化剂的变化对自由基作出评价[3]。本实验的EPR检测结果显示，快速减压后90 min时，肺组织内OR生成增加，与此相对应，生化测定显示此时动物体内SOD活性降低，MDA含量升高。这说明，减压病可引起体内自由基增加，并对机体造成一定程度的损伤。根据DCS的发病机理知道，高压氧暴露后的快速减压使机体产生大量气泡，这些气泡最后集中于肺，引起肺循环栓塞、血流瘀滞以及白细胞聚集并激活[4]。这些都可引起肺内自由基生成增加。
HBO已广泛用于临床上多种疾病的治疗，同时也是治疗DCS的重要措施[5]。本实验进一步观察到，HBO明显抑制快速减压后OR的增生，同时也使SOD和MDA回复到对照水平，说明HBO通过减少OR的生成和加强对OR的清除起到抗氧化作用，减轻DCS时OS程度，防止或减轻组织损伤，常压纯氧也有类似作用，提示在不具备高压氧设备的情况下，为减轻OR对机体的损伤，也可考虑采用常压纯氧来代替。
, http://www.100md.com
维生素C是体内最有效的水溶性抗氧化剂[6]，它还原OR的同时自身变成维生素C自由基，其中一部分经谷胱甘肽变为还原型维生素C，另一部分经古洛糖酸途径代谢排出体外。所以维生素C的抗氧化过程是自身消耗过程。本实险中未发现维生素C含量随OR增加而减少。这是一个矛盾现象，有待今后作进一步探讨。
作者单位：朱祥祺(200433 上海，海军医学研究所)
倪大智(200433 上海，海军医学研究所)
李慈(200433 上海，海军医学研究所)
陈士明(复旦大学测试中心)
严小敏(复旦大学测试中心)
参考文献
, 百拇医药
1，Gutteridge JM.Biological origin of free radicals,and mechanisms of antioxidant protection.Chem Biol interact,1990,91:113-140.
2，Coghlan JG,Flitter W,Holley AE,et al.Detection of free radicals and cholesterol hydroperoxides of in blood taken from the coronary sinus of man during percutaneous transluminal coronary angioplasty.Free Rad Res Comm,1991,14:409-417.
3，Smith CV.Correlation and apparent contradictions in assessment of oxidant stress status in vivo.Free Rad Biol Med,1991,10:217-220.
4，Anderson JC,Bennett PB.Hematologic change caused by deep trimix diving.The Atlantis IVexperience.Undersea Biomed Res,1981,8:43.
5，Workman RH.Treatment of bends with oxygen at high pressure.Aerospace Med,1968,39:1076-1085.
6，Niki E.Vitamin C as antioxidant.World Rev Nutr Diet，1991,64:1-30., 百拇医药