MTT比色法测定药物对HeLa细胞作用的实验研究
MTT比色法测定药物对HeLa细胞作用的实验研究
彭勤 彭惠 骆云鹏 汤为学
摘 要 目的：观察顺铂、5-FU、甲氨蝶呤在体外对人宫颈肿瘤细胞的作用。方法：用MTT测定法观察以上3种化疗药物单用及合用对HeLa细胞的影响，用流式细胞仪观察凋亡及细胞周期的变化。结果：顺铂和5-FU单独应用及合用时，随着药物剂量增加抑制效应增加。结论：顺铂和5-FU能有效抑制HeLa细胞的生长，甲氨蝶呤在本实验条件下无此作用。
关键词：宫颈肿瘤；HeLa细胞；顺铂；氟尿嘧啶；甲氨蝶呤；药物疗法
为临床用药化疗提供依据，我们观察了体外应用顺铂(Cisplatin,PDD)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)和甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)3种药物对人宫颈癌细胞系HeLa细胞的作用，现将结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养 HeLa细胞株在含10%小牛血清RPMI1640(美国Gibco)培养液中(内含0.1%青霉素、链霉素)培养并置于37℃，7%CO2饱和湿度的培养箱内备用。
1.2 药物 PDD系齐鲁制药厂产，5-FU系天津人民制药厂产，MTX系上海华联制药有限公司产，使用时新鲜配制，其终浓度PDD为40，20，10，5，2.5μg/ml,5-FU为400，200，100，50，25μg/ml，MTX为40，20，10，5，2.5μg/ml。
1.3 药物抑制试验 制成5×104/ml细胞悬液，置入96孔培养板内，每孔200μl。实验设肿瘤细胞阴性对照组及各种药物试验组。将3种单药的5个不同浓度分别加在96孔板内，每孔加20μl。每种剂量6个平行孔。两组合用(PDD+5FU,PDD+MTX,5-FU+MTX)采用1：1的方案，每孔总药量仍为20μl(每种单药剂量浓缩1倍各加10μl)，药物作用68h后，2000r/min离心10min，弃上清每孔加入MTT20μl，37℃培养箱中培养4h，再离心弃上清后每孔加二甲亚砜200μl，微量振荡器振荡5min，自动酶标读数仪比色(波长600nm)，测光密度并计算药物对HeLa细胞的抑制率。HeLa细胞存活率=抗癌药物组光密度值/细胞对照组光密度值×100%，抑制率=100%-存活率。
, 百拇医药
1.4 流式细胞仪检查 制成2×10 5/ml细胞悬液，设正常肿瘤细胞阴性对照和PDD(5μg/ml)、5-FU(50μg/ml)及PDD+5-FU(5+50μg/ml)作用48h的实验组。消化后，用PBS液洗两次，轻轻打匀细胞，用75%酒精(1～2ml)固定，用流式细胞仪分析。
1.5 统计学方法 每份标本平行测定6孔，求其X±s,采用SAS软件方差分析，q检验，每个药物试验组与阴性对照组比较。
2 结 果
2.1 MTX、5-FU和PDD单用及合用对HeLa细胞的影响 MTX各实验组经统计学处理与对照组无明显差异。IC50:5-FU为14.430mg/L,PDD为0.604mg/L及PDD+5-FU为13.913mg/L(其中PDD 0.552mg/L,5-FU13.361mg/L)。5-FU、PDD及PDD+5-FU药物组，随药物浓度的增加，存活率逐渐降低，抑制率逐渐增加(P<0.001)，见表1。
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表1 MTT法测定5-FU和PDD单用及合用对HeLa细胞的影响(n=6,ρ/μg.L-1，X±s)
组别
光密度(OD)值
存活率(%)
抑制率(%)
F值
P值
对照组
0.516±0.082
5-FU组
72.05
, 百拇医药
0.0001
25
50
100
200
400
0.259±0.050*
0.215±0.030*
0.147±0.039*
0.132±0.033*
0.119±0.014*
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44.38
41.67
28.49
25.58
23.06
55.62
58.33
71.51
74.41
76.94
PDD组
34.57
0.0001
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2.5
5
10
20
40
0.115±0.038*
0.099±0.007*
0.076±0.021
0.041±0.011*
0.019±0.080
22.29
, 百拇医药
19.19
14.73
7.95
3.58
77.71
80.81
85.27
92.05
96.42
PDD+5-FU组
139.15
0.0001
2.5+25
, 百拇医药
5+50
10+100
20+200
40+400
0.119±0.043
0.097±0.031*
0.082±0.021*
0.051±0.014*
0.042±0.070*
23.06
, 百拇医药 18.80
15.89
9.88
8.14
76.93
81.20
84.11
90.12
91.86
P<0.05 vs 对照组
2.2 流式细胞仪分析 用流式细胞仪观察正常肿瘤细胞阴性对照和PDD(5μg/ml)、5-FU(50μg/ml)及PDD+5-FU(5+50μg/ml)作用48h 4个实验组细胞周期的变化，PDD及PDD+5-FU组使细胞滞留于G0～G1期，5-FU使细胞主要滞留于S期，这3种药物组均可见凋亡峰，见表2。 表2 正常肿瘤细胞阴性对照和各药物组48h
, 百拇医药
HeLa细胞周期的变化(%)
Go～Gl
G2-M
S
Apoptosis
对照组
67.10
11.94
20.96
PDD组
79.51
0
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20.49
18.18
5-FU组
36.65
22.94
40.41
14.95
PDD+5-FU组
72.54
0.51
26.95
17.58
3 讨 论
, 百拇医药
MTT法的作用原理是哺乳类动物类活细胞线粒体内膜中的呼吸链上与呼吸链有关的酶，可将MTT降解成紫蓝色的甲月 替结晶，结晶量与活细胞数成正比。加入二甲亚砜溶解结晶，通过比色测定即可推算出活细胞的数量，该方法结果准确，可靠，可作为常规筛选抗癌药物的方法。
宫颈肿瘤的治疗取得了很大进展，但仍有部分患者特别是局部肿瘤较大或有区域淋巴转移的患者，初治后仍肿瘤未被控，复发及转移。因此，学者们把注意力转移到化学治疗上。5-FU为尿嘧啶类抗代谢药，能干扰核酸和DNA的生物合成，属周期特异性药物，主要杀灭S期细胞，它又能以伪代谢物形式掺入RNA中影响其功能，因此，对增殖细胞各期都有影响。PDD是广谱抗癌药物，它主要通过交叉连结抑制肿瘤细胞RNA及蛋白质的合成，属细胞周期非特异药物。MTX为抗叶酸类抗肿瘤药，主要通过对二氢叶酸还原酶的竞争性抑制发挥作用，能较特异地作用于DNA合成期S期。PDD、5-FU这两种抗癌药物单用及合用时在体外对HeLa细胞的抑制作用均较好，并随药物剂量增加，抑制作用增强。MTX在此研究条件下对HeLa细胞无明显抑制作用，其机理有待进一步探讨。用流式细胞仪分析表明，PDD及PDD+5-FU组使细胞滞留于Go～Gl期，5-FU使细胞主要滞留于S期，从而抑制细胞增生，产生细胞毒作用，出现凋亡峰。此研究结果为临床正确使用化疗药物及联合运用提供了参考依据。
, 百拇医药
第一作者简介：彭勤，46岁，重庆医科大学附属第一医院妇产科主治医师，医学硕士。主要研究方向：妇科肿瘤及妇产科遗传学。
彭勤(重庆医科大学附属第一医院，400016)
彭惠(重庆医科大学附属第一医院，400016)
骆云鹏(重庆医科大学病理生理学教研室)
汤为学(重庆医科大学病理生理学教研室)
参考文献
1，汤 钊 猷. 现 代 肿 瘤 学. 上 海： 上 海 医 科 大 学 出 版 社，1993.705
2，Kristin R,Ignace,BV,Janne K,etal.Bleomycin-lfos-famide-Cis-Platinum(BIP) in pelvie recurrence of previously irradiated cervical carcimoma:A second look.Gynecol Oncol,1992,46:203-208
, 百拇医药
3，汤为学，骆云鹏，王瑞雪.人实体瘤抗癌药物敏感试验MTT法的建立.重庆医科大学学报，1992，17(21)：103
4，Smith KS,Folz BA.Synergistic and additive combination of several antitumor drugs and other agents with the potent alkylating agent adozelesin.Cancer Chemother Pharmacol,1995,35(6):471-474
5，Chang HC,Lai CH,Chen MS,et al.Preliminary results of concurrent radiotherapy and chemotheraphy with cisplatin,vincristine,and blemycin in bulky,advanced cervical carcinoma:A pilot study.Gynecol Oncol,1992,44:182-187
6，Garton GR,Gunderson LL,Webb MJ,et al.Intraoperative radiation therapy in gynecologic cancer:The mayoclinic experience.Gynecol Oncol,1993,48:328-334
7，Mark.EP,Ronald DA, Frank LG, et al. Optimal therapy for pelivic recurrence after radical hystere ctomy for earlystage cervical cancer.Gynecol Oncol,1990,37:74-79, http://www.100md.com
彭勤 彭惠 骆云鹏 汤为学
摘 要 目的：观察顺铂、5-FU、甲氨蝶呤在体外对人宫颈肿瘤细胞的作用。方法：用MTT测定法观察以上3种化疗药物单用及合用对HeLa细胞的影响，用流式细胞仪观察凋亡及细胞周期的变化。结果：顺铂和5-FU单独应用及合用时，随着药物剂量增加抑制效应增加。结论：顺铂和5-FU能有效抑制HeLa细胞的生长，甲氨蝶呤在本实验条件下无此作用。
关键词：宫颈肿瘤；HeLa细胞；顺铂；氟尿嘧啶；甲氨蝶呤；药物疗法
为临床用药化疗提供依据，我们观察了体外应用顺铂(Cisplatin,PDD)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)和甲氨蝶呤(Methotrexate,MTX)3种药物对人宫颈癌细胞系HeLa细胞的作用，现将结果报告如下。
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1 材料与方法
1.1 细胞培养 HeLa细胞株在含10%小牛血清RPMI1640(美国Gibco)培养液中(内含0.1%青霉素、链霉素)培养并置于37℃，7%CO2饱和湿度的培养箱内备用。
1.2 药物 PDD系齐鲁制药厂产，5-FU系天津人民制药厂产，MTX系上海华联制药有限公司产，使用时新鲜配制，其终浓度PDD为40，20，10，5，2.5μg/ml,5-FU为400，200，100，50，25μg/ml，MTX为40，20，10，5，2.5μg/ml。
1.3 药物抑制试验 制成5×104/ml细胞悬液，置入96孔培养板内，每孔200μl。实验设肿瘤细胞阴性对照组及各种药物试验组。将3种单药的5个不同浓度分别加在96孔板内，每孔加20μl。每种剂量6个平行孔。两组合用(PDD+5FU,PDD+MTX,5-FU+MTX)采用1：1的方案，每孔总药量仍为20μl(每种单药剂量浓缩1倍各加10μl)，药物作用68h后，2000r/min离心10min，弃上清每孔加入MTT20μl，37℃培养箱中培养4h，再离心弃上清后每孔加二甲亚砜200μl，微量振荡器振荡5min，自动酶标读数仪比色(波长600nm)，测光密度并计算药物对HeLa细胞的抑制率。HeLa细胞存活率=抗癌药物组光密度值/细胞对照组光密度值×100%，抑制率=100%-存活率。
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1.4 流式细胞仪检查 制成2×10 5/ml细胞悬液，设正常肿瘤细胞阴性对照和PDD(5μg/ml)、5-FU(50μg/ml)及PDD+5-FU(5+50μg/ml)作用48h的实验组。消化后，用PBS液洗两次，轻轻打匀细胞，用75%酒精(1～2ml)固定，用流式细胞仪分析。
1.5 统计学方法 每份标本平行测定6孔，求其X±s,采用SAS软件方差分析，q检验，每个药物试验组与阴性对照组比较。
2 结 果
2.1 MTX、5-FU和PDD单用及合用对HeLa细胞的影响 MTX各实验组经统计学处理与对照组无明显差异。IC50:5-FU为14.430mg/L,PDD为0.604mg/L及PDD+5-FU为13.913mg/L(其中PDD 0.552mg/L,5-FU13.361mg/L)。5-FU、PDD及PDD+5-FU药物组，随药物浓度的增加，存活率逐渐降低，抑制率逐渐增加(P<0.001)，见表1。
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表1 MTT法测定5-FU和PDD单用及合用对HeLa细胞的影响(n=6,ρ/μg.L-1，X±s)
组别
光密度(OD)值
存活率(%)
抑制率(%)
F值
P值
对照组
0.516±0.082
5-FU组
72.05
, 百拇医药
0.0001
25
50
100
200
400
0.259±0.050*
0.215±0.030*
0.147±0.039*
0.132±0.033*
0.119±0.014*
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44.38
41.67
28.49
25.58
23.06
55.62
58.33
71.51
74.41
76.94
PDD组
34.57
0.0001
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2.5
5
10
20
40
0.115±0.038*
0.099±0.007*
0.076±0.021
0.041±0.011*
0.019±0.080
22.29
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19.19
14.73
7.95
3.58
77.71
80.81
85.27
92.05
96.42
PDD+5-FU组
139.15
0.0001
2.5+25
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5+50
10+100
20+200
40+400
0.119±0.043
0.097±0.031*
0.082±0.021*
0.051±0.014*
0.042±0.070*
23.06
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15.89
9.88
8.14
76.93
81.20
84.11
90.12
91.86
P<0.05 vs 对照组
2.2 流式细胞仪分析 用流式细胞仪观察正常肿瘤细胞阴性对照和PDD(5μg/ml)、5-FU(50μg/ml)及PDD+5-FU(5+50μg/ml)作用48h 4个实验组细胞周期的变化，PDD及PDD+5-FU组使细胞滞留于G0～G1期，5-FU使细胞主要滞留于S期，这3种药物组均可见凋亡峰，见表2。 表2 正常肿瘤细胞阴性对照和各药物组48h
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HeLa细胞周期的变化(%)
Go～Gl
G2-M
S
Apoptosis
对照组
67.10
11.94
20.96
PDD组
79.51
0
, http://www.100md.com
20.49
18.18
5-FU组
36.65
22.94
40.41
14.95
PDD+5-FU组
72.54
0.51
26.95
17.58
3 讨 论
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MTT法的作用原理是哺乳类动物类活细胞线粒体内膜中的呼吸链上与呼吸链有关的酶，可将MTT降解成紫蓝色的甲月 替结晶，结晶量与活细胞数成正比。加入二甲亚砜溶解结晶，通过比色测定即可推算出活细胞的数量，该方法结果准确，可靠，可作为常规筛选抗癌药物的方法。
宫颈肿瘤的治疗取得了很大进展，但仍有部分患者特别是局部肿瘤较大或有区域淋巴转移的患者，初治后仍肿瘤未被控，复发及转移。因此，学者们把注意力转移到化学治疗上。5-FU为尿嘧啶类抗代谢药，能干扰核酸和DNA的生物合成，属周期特异性药物，主要杀灭S期细胞，它又能以伪代谢物形式掺入RNA中影响其功能，因此，对增殖细胞各期都有影响。PDD是广谱抗癌药物，它主要通过交叉连结抑制肿瘤细胞RNA及蛋白质的合成，属细胞周期非特异药物。MTX为抗叶酸类抗肿瘤药，主要通过对二氢叶酸还原酶的竞争性抑制发挥作用，能较特异地作用于DNA合成期S期。PDD、5-FU这两种抗癌药物单用及合用时在体外对HeLa细胞的抑制作用均较好，并随药物剂量增加，抑制作用增强。MTX在此研究条件下对HeLa细胞无明显抑制作用，其机理有待进一步探讨。用流式细胞仪分析表明，PDD及PDD+5-FU组使细胞滞留于Go～Gl期，5-FU使细胞主要滞留于S期，从而抑制细胞增生，产生细胞毒作用，出现凋亡峰。此研究结果为临床正确使用化疗药物及联合运用提供了参考依据。
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第一作者简介：彭勤，46岁，重庆医科大学附属第一医院妇产科主治医师，医学硕士。主要研究方向：妇科肿瘤及妇产科遗传学。
彭勤(重庆医科大学附属第一医院，400016)
彭惠(重庆医科大学附属第一医院，400016)
骆云鹏(重庆医科大学病理生理学教研室)
汤为学(重庆医科大学病理生理学教研室)
参考文献
1，汤 钊 猷. 现 代 肿 瘤 学. 上 海： 上 海 医 科 大 学 出 版 社，1993.705
2，Kristin R,Ignace,BV,Janne K,etal.Bleomycin-lfos-famide-Cis-Platinum(BIP) in pelvie recurrence of previously irradiated cervical carcimoma:A second look.Gynecol Oncol,1992,46:203-208
, 百拇医药
3，汤为学，骆云鹏，王瑞雪.人实体瘤抗癌药物敏感试验MTT法的建立.重庆医科大学学报，1992，17(21)：103
4，Smith KS,Folz BA.Synergistic and additive combination of several antitumor drugs and other agents with the potent alkylating agent adozelesin.Cancer Chemother Pharmacol,1995,35(6):471-474
5，Chang HC,Lai CH,Chen MS,et al.Preliminary results of concurrent radiotherapy and chemotheraphy with cisplatin,vincristine,and blemycin in bulky,advanced cervical carcinoma:A pilot study.Gynecol Oncol,1992,44:182-187
6，Garton GR,Gunderson LL,Webb MJ,et al.Intraoperative radiation therapy in gynecologic cancer:The mayoclinic experience.Gynecol Oncol,1993,48:328-334
7，Mark.EP,Ronald DA, Frank LG, et al. Optimal therapy for pelivic recurrence after radical hystere ctomy for earlystage cervical cancer.Gynecol Oncol,1990,37:74-79, http://www.100md.com