r-干扰素对血管平滑肌细胞一氧化氮合酶mRNA表达的影响
r-干扰素对血管平滑肌细胞一氧化氮合酶mRNA表达的影响
李建军 黄从新 李庚山 上野光
摘 要 探讨r-干扰素(INF-r)对培养血管平滑肌细胞(SMC)诱生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达的影响。0.5%血清培养48 h后的大鼠主动脉SMC，加入150μ/ml的INF-r入培养基中，于0、1、3、6和12 h获取细胞标本，提取总RNA，采用Northern杂交检测iNOS mRNA在SMC中的表达水平。结果经INF-r刺激后，SMC中iNOS mRNA的表达水平明显增高，3h达高峰为对照水平的8倍，12h后渐降。INF-r可刺激血管SMC iNOS mRNA表达水平上调，其作用可能与感染性休克的发生及SMC增殖受抑制等有关。
关键词：r-干扰素；平滑肌细胞；一氧化氮合酶
, http://www.100md.com
一氧化氮(NO)是一种具有多种心血管作用的活性物质，其产生多由诱生型一氧化氮合酶(iNOS)催化，具有显著的舒张血管，降低血压及抑制血管平滑肌细胞(SMC)增殖等作用[1～5]。r-干扰素(INF-r)是一种由激活的T淋巴细胞分泌的一种细胞因子。动物实验证实，静脉注射INF-r可抑制气囊损伤引起的内膜增厚，且参与了感染性休克的发生与发展，但其作用机理尚不十分清楚。作者推测INF-r刺激血管SMC使NO产生增多可能为其机理之一。据此，我们观察了INF-r对培养SMC iNOS mRNA表达的影响，现报道如下。
材料与方法
1.大鼠主动脉SMC的培养 大鼠主动脉SMC的培养采用McMurray等[6]报道的贴片法获得。断头法处死大鼠，迅即在无菌操作下取出主动脉，分离血管中膜并剪成约0.5×0.5cm2碎片，均匀贴附于25ml卡氏培养瓶中，加入含20%小牛血清的DMEM培养液于37℃的CO2孵育箱内培养。约1周左右可见SMC从组织块周围萌出，待原代培养细胞生长融合达75%～90%培养面时即用0.1%胰酶消化传代增殖，选用第3～5代细胞作为实验用细胞。
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分组将3～5代SMC培养于78cm2培养皿中，用含10%小牛血清的DMEM培养液培养至接近汇合时，换用含0.5%小牛血清的DMEM培养48 h。继之改用无血清DMEM但含150μ/ml INF-r(Sigma)培养液培养至指定时间。
2.细胞总RNA的提取 细胞加入INF-r刺激后0、1、3、6和12 h(n=4)后，使用TRIZOL Reagent(Gibco)并按操作说明提取细胞总RNA，0.8%甲醛凝胶电泳鉴定RNA，见有清晰的18S和28S电泳带，OD260/OD280约为2，则进入Northern杂交分析。
3.Northern杂交 iNOS信使核糖核酸(mRNA)的互补脱氧核糖核酸(cDNA)探针长1.8kb，购于Cayman Chemical公司。内对照18S rRNA探针长1.2kb，购自于Ambion公司。[α-32P]dCTP (3000ci/mmol)用DNA随机引物标记盒(Amershan)按说明书进行探针标记。比活性为3～10×107cpm/μg。
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30μg的细胞总RNA在50%甲醛胺，2.2mmol/L甲醛、1XMOPS中加热65℃×5min变性后，在含2.5mmol/L甲醛的1.2%琼脂糖凝胶上电泳。电泳液为1XMOPS。电泳后的RNA按毛细管洗脱法转印至尼龙膜上。嗣后于42℃预杂交6 h，预杂交液为50%甲酰胺，5XSSPE、5XDenhardt液、1%SDS及200ug/ml ssDNA。然后在预杂交液中加入25～50ng的随机引物32P-DNA探针于42℃进行杂交24 h。选用含2XSSPE/0.1%SDS、0.2XSSPE及0.2XSSPE/0.1%SDS三种液体分别洗膜后，空气凉干尼龙膜，用双中速增感屏暗盒压片(Kodak),-70℃冰箱中曝光24～72 h。胶片显影带用密度扫描仪(Moleaular dynamics lnc)进行半定量分析。
结 果
大鼠主动脉SMC经48 h含0.5%小牛血清的DMEM培养后，经Northern杂交检测，未见明显的iNOS mRNA表达。经含有150u/ml INF-r培养液刺激后1h，iNOS mRNA表达开始出现，3 h达高峰，12h则渐下降，呈骤升渐降趋势(图1)。
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经密度扫描半定量分析表明，受INF-r的刺激，SMC iNOS mRNA表达水平在3 h时较对照增高8倍，6 h为6倍，12 h为3倍。
讨 论
中毒性休克是感染患者的常见并发症，死亡率极高。中毒性休克的发病机理极其复杂。目前认为在初始阶段是内毒素(LPS)或类似物质进入血液后诱发许多活性物质的释放，后者与邻近的细胞、组织作用，产生一系列病理生理改变。最终导致代谢紊乱，休克而死亡。在内毒素释放的众多活性物质中，INF-r起着极为重要的作用[4]。实验研究证实，患脑膜炎双球菌感染性疾病的患者血清中INF-r水平与休克的严重性及死亡率成正比[1]。感染性休克时，细胞因子包括INF-r可激活SMC和巨噬细胞的iNOS，使NO产生增加，导致血管扩张和低血压，后二者被视为感染性休克的重要特征[4，5]。
图1 Northem杂交检测INF-r对
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培养SMC诱生型iNOS mRNA
表达的影响及其时间变化
此外，NO系90年代研究热点之一，它由L-精氨酸和氧分子在NOS作用下合成，除具有松弛血管SMC外，还具有抑制SMC增殖等重要作用[3]。有趣的是INF-r已被证实为细胞增殖的负性调节因素，可抑制血管SMC的增生，但其作用机制尚不十分清楚[2]。有学者认为与INF-r刺激NO的产生不无关系[3]。本研究提示，INF-r系血管SMC iNOS表达的刺激因子，推测INF-r参与感染性休克的发生，抑制血管SMC增殖，部分是与INF-r刺激SMC iNOS产生增加，NO水平增高有关。
李建军(湖北医科大学附属一院 心内科 430060)
黄从新(湖北医科大学附属一院 心内科 430060)
, http://www.100md.com
李庚山(湖北医科大学附属一院 心内科 430060)
上野光(湖北医科大学附属一院 心内科 430060)
参考文献
1，Cooke JP.Dzau VJ.Derangements of the nitric oxide synthase pathway,L-arginine,and cardiovascular disease.Circulation,1997,96:379～382.
2，Garg VC,Hassid A.Nitric oxide-generation vasodilators and 8-bromo-cyclic guanosine monophosphate inhibit mitogenesis and proliferation of cultured rat smooth muscle cells.J Clin lnvest,1989,83:1774～1777.
, http://www.100md.com
3，Nilsson J.Cytokines and smooth musclecells in atherossclerosis.Cardiovasc Res,1993,27:1184～1189.
4，Glausser MP,Zanetti G,Baumgarther JD,et al.Septic shock:pathogenesis.Lancet,1991,338:732～736.
5，Thiemermann C,Vane J R.Inhibition of nitric oxide synthesis reduces the hypotension induced by bacterial lipopolysaccharides in the rat in vivo.Eur J Pharmacol,1990,182:591～595.
6，McMurray HF,Parrot DP,Bowyer DE.A standard method of culturing aortic explants,suitable for the study of factors affecting the phenotypic modulation,migration and proliferation of aortic smooth muscle cells.Atherosclerosis,1991,86:227～235., http://www.100md.com
李建军 黄从新 李庚山 上野光
摘 要 探讨r-干扰素(INF-r)对培养血管平滑肌细胞(SMC)诱生型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达的影响。0.5%血清培养48 h后的大鼠主动脉SMC，加入150μ/ml的INF-r入培养基中，于0、1、3、6和12 h获取细胞标本，提取总RNA，采用Northern杂交检测iNOS mRNA在SMC中的表达水平。结果经INF-r刺激后，SMC中iNOS mRNA的表达水平明显增高，3h达高峰为对照水平的8倍，12h后渐降。INF-r可刺激血管SMC iNOS mRNA表达水平上调，其作用可能与感染性休克的发生及SMC增殖受抑制等有关。
关键词：r-干扰素；平滑肌细胞；一氧化氮合酶
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一氧化氮(NO)是一种具有多种心血管作用的活性物质，其产生多由诱生型一氧化氮合酶(iNOS)催化，具有显著的舒张血管，降低血压及抑制血管平滑肌细胞(SMC)增殖等作用[1～5]。r-干扰素(INF-r)是一种由激活的T淋巴细胞分泌的一种细胞因子。动物实验证实，静脉注射INF-r可抑制气囊损伤引起的内膜增厚，且参与了感染性休克的发生与发展，但其作用机理尚不十分清楚。作者推测INF-r刺激血管SMC使NO产生增多可能为其机理之一。据此，我们观察了INF-r对培养SMC iNOS mRNA表达的影响，现报道如下。
材料与方法
1.大鼠主动脉SMC的培养 大鼠主动脉SMC的培养采用McMurray等[6]报道的贴片法获得。断头法处死大鼠，迅即在无菌操作下取出主动脉，分离血管中膜并剪成约0.5×0.5cm2碎片，均匀贴附于25ml卡氏培养瓶中，加入含20%小牛血清的DMEM培养液于37℃的CO2孵育箱内培养。约1周左右可见SMC从组织块周围萌出，待原代培养细胞生长融合达75%～90%培养面时即用0.1%胰酶消化传代增殖，选用第3～5代细胞作为实验用细胞。
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分组将3～5代SMC培养于78cm2培养皿中，用含10%小牛血清的DMEM培养液培养至接近汇合时，换用含0.5%小牛血清的DMEM培养48 h。继之改用无血清DMEM但含150μ/ml INF-r(Sigma)培养液培养至指定时间。
2.细胞总RNA的提取 细胞加入INF-r刺激后0、1、3、6和12 h(n=4)后，使用TRIZOL Reagent(Gibco)并按操作说明提取细胞总RNA，0.8%甲醛凝胶电泳鉴定RNA，见有清晰的18S和28S电泳带，OD260/OD280约为2，则进入Northern杂交分析。
3.Northern杂交 iNOS信使核糖核酸(mRNA)的互补脱氧核糖核酸(cDNA)探针长1.8kb，购于Cayman Chemical公司。内对照18S rRNA探针长1.2kb，购自于Ambion公司。[α-32P]dCTP (3000ci/mmol)用DNA随机引物标记盒(Amershan)按说明书进行探针标记。比活性为3～10×107cpm/μg。
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30μg的细胞总RNA在50%甲醛胺，2.2mmol/L甲醛、1XMOPS中加热65℃×5min变性后，在含2.5mmol/L甲醛的1.2%琼脂糖凝胶上电泳。电泳液为1XMOPS。电泳后的RNA按毛细管洗脱法转印至尼龙膜上。嗣后于42℃预杂交6 h，预杂交液为50%甲酰胺，5XSSPE、5XDenhardt液、1%SDS及200ug/ml ssDNA。然后在预杂交液中加入25～50ng的随机引物32P-DNA探针于42℃进行杂交24 h。选用含2XSSPE/0.1%SDS、0.2XSSPE及0.2XSSPE/0.1%SDS三种液体分别洗膜后，空气凉干尼龙膜，用双中速增感屏暗盒压片(Kodak),-70℃冰箱中曝光24～72 h。胶片显影带用密度扫描仪(Moleaular dynamics lnc)进行半定量分析。
结 果
大鼠主动脉SMC经48 h含0.5%小牛血清的DMEM培养后，经Northern杂交检测，未见明显的iNOS mRNA表达。经含有150u/ml INF-r培养液刺激后1h，iNOS mRNA表达开始出现，3 h达高峰，12h则渐下降，呈骤升渐降趋势(图1)。
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经密度扫描半定量分析表明，受INF-r的刺激，SMC iNOS mRNA表达水平在3 h时较对照增高8倍，6 h为6倍，12 h为3倍。
讨 论
中毒性休克是感染患者的常见并发症，死亡率极高。中毒性休克的发病机理极其复杂。目前认为在初始阶段是内毒素(LPS)或类似物质进入血液后诱发许多活性物质的释放，后者与邻近的细胞、组织作用，产生一系列病理生理改变。最终导致代谢紊乱，休克而死亡。在内毒素释放的众多活性物质中，INF-r起着极为重要的作用[4]。实验研究证实，患脑膜炎双球菌感染性疾病的患者血清中INF-r水平与休克的严重性及死亡率成正比[1]。感染性休克时，细胞因子包括INF-r可激活SMC和巨噬细胞的iNOS，使NO产生增加，导致血管扩张和低血压，后二者被视为感染性休克的重要特征[4，5]。
图1 Northem杂交检测INF-r对
, 百拇医药
培养SMC诱生型iNOS mRNA
表达的影响及其时间变化
此外，NO系90年代研究热点之一，它由L-精氨酸和氧分子在NOS作用下合成，除具有松弛血管SMC外，还具有抑制SMC增殖等重要作用[3]。有趣的是INF-r已被证实为细胞增殖的负性调节因素，可抑制血管SMC的增生，但其作用机制尚不十分清楚[2]。有学者认为与INF-r刺激NO的产生不无关系[3]。本研究提示，INF-r系血管SMC iNOS表达的刺激因子，推测INF-r参与感染性休克的发生，抑制血管SMC增殖，部分是与INF-r刺激SMC iNOS产生增加，NO水平增高有关。
李建军(湖北医科大学附属一院 心内科 430060)
黄从新(湖北医科大学附属一院 心内科 430060)
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李庚山(湖北医科大学附属一院 心内科 430060)
上野光(湖北医科大学附属一院 心内科 430060)
参考文献
1，Cooke JP.Dzau VJ.Derangements of the nitric oxide synthase pathway,L-arginine,and cardiovascular disease.Circulation,1997,96:379～382.
2，Garg VC,Hassid A.Nitric oxide-generation vasodilators and 8-bromo-cyclic guanosine monophosphate inhibit mitogenesis and proliferation of cultured rat smooth muscle cells.J Clin lnvest,1989,83:1774～1777.
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3，Nilsson J.Cytokines and smooth musclecells in atherossclerosis.Cardiovasc Res,1993,27:1184～1189.
4，Glausser MP,Zanetti G,Baumgarther JD,et al.Septic shock:pathogenesis.Lancet,1991,338:732～736.
5，Thiemermann C,Vane J R.Inhibition of nitric oxide synthesis reduces the hypotension induced by bacterial lipopolysaccharides in the rat in vivo.Eur J Pharmacol,1990,182:591～595.
6，McMurray HF,Parrot DP,Bowyer DE.A standard method of culturing aortic explants,suitable for the study of factors affecting the phenotypic modulation,migration and proliferation of aortic smooth muscle cells.Atherosclerosis,1991,86:227～235., http://www.100md.com