视网膜色素上皮细胞移植的研究
视网膜色素上皮细胞移植的研究
张钧 盛耀华
关键词：视网膜色素上皮；上皮细胞；细胞移植；免疫排斥；老年黄斑变性
视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)由排列规则的单层细胞构成，位于视网膜神经上皮层和Bruch膜之间，由于其特殊的解剖学位置，它在视网膜中起着重要的作用[1]。RPE、Bruch膜和脉络膜毛细血管的进行性病变可危及视网膜感光细胞，形成视网膜下的新生血管膜，比如老年黄斑变性(age-related macular degeneration,ARMD)。传统的光凝疗法预后不佳，尤其在黄斑区[2，3]。近年来成功开展了视网膜下膜的“剥膜”手术，由于同时丧失了RPE细胞，要求移植以作补充。由此带来了以下新课题：(1)RPE的取材与培养；(2)移植新技术的开展；(3)移植免疫机制的研究；(4)免疫抑制剂的应用；(5)术后并发症的处理。
, 百拇医药
1 实验方法
目前主要限于动物实验，包括：同种异体的灵长类、兔[4-6]；异种异体的人胎眼至兔、猴[5，7]；Algvere等曾进行过人胎眼至人的移植。首先用胰蛋白酶消化、分离RPE细胞，放入37℃的CO2培养箱2～3wk，取得材料。大多通过外路(穿透后巩膜途径)或内路(玻璃体-视网膜途径)2种方法[5，8-10]，将经培养的或原代的RPE细胞植入宿主的视网膜下腔。(1)外路法：分离并剪断上直肌，暴露近黄斑区的后巩膜，作厚近全层的巩膜瓣，用特制针头刺破其下的脉络膜约4mm，将RPE细胞注入视网膜下腔。本法植入的RPE细胞数量较多，一般不会造成医源孔，但操作难度较大，定位困难，开展不很成熟；(2)内路法：经睫状体扁平部的切口，先行玻璃体切割，再用特制针头刺破中央凹颞上方的视网膜，注入平衡液造成小范围的网脱，然后植入RPE细胞。本法是在直视下手术，较为精细、效果好，但易造成医源孔，而且如何处理视网膜注射孔也较麻烦，临床上一般要经气-液交换或注入硅油以封闭该孔[8]。有研究认为，移植同种的RPE细胞效果好于异种移植[7]，移植片状的RPE细胞效果好于游离的，移植年轻、健康的RPE细胞效果好于成年的[12](而且这一点被认为是必需的[13])，考虑极性移植的RPE细胞优于丧失极性者[5]。
, 百拇医药
2 动物实验
通过上述方法将RPE细胞植入视网膜下腔，单个或成串排列，一般在21d后与Bruch膜[14]和感光细胞外段接触，至少可存活3mo[8]。移植的RPE细胞能保持完整性、形态、色素达5mo之久[15]，并且还能挽救视网膜的功能，此点已被实验中的ERG证实[16，17]。在人至猴移植中，通过电镜发现[15]：术后1wk脉络膜血管下出现单核细胞浸润，预示将有免疫排斥反应发生，术后1mo该反应变得明显；通过荧光造影还发现：术后7～9wk移植区域内无渗漏，晚期在相应黄斑水肿的部位出现荧光。慢性渗漏大多发生在湿型ARMD病例，而很少见于干型ARMD者[18]。同种异体移植的反应轻于异种异体移植。有人认为植入的RPE细胞会演变成纤维母细胞和巨噬细胞，但同样有人认为它们仅仅是形态上相象而已，并非真正转变[19]。目前主要借助普通眼底镜、扫描激光眼底镜(SLO)、荧光造影、微视野计进行随访观察。黄斑囊样水肿是主要的术后并发症，可造成视力骤降[8]。原因是宿主移植免疫排斥反应和手术机械性创伤所致。
, 百拇医药
3 植入RPE的作用
大量的动物实验表明[13，14，17-22]，移植后的RPE细胞能：(1)挽救感光细胞，维持其完整性(特别是外段)；(2)有助于失活的视网膜保持S抗原并延缓mRNA的降解；(3)防止视网膜新生血管的产生、正常血管的萎缩并保持其内平衡；(4)维持传导过程中膜整合蛋白的基因表达和合成；(5)通过吞噬作用去除碎片；(6)再建感光细胞的细胞间质、维持外丛状层的突触联系，延缓内外核层细胞的衰老；(7)分泌某种营养因子。
4 移植免疫
现已充分表明，视网膜下腔是一个免疫赦免部位，但不是绝对的和静止的[25]。血-视网膜屏障的破坏可造成慢性排斥反应[18]，中心凹区强于周边部[26]，人至兔移植强于、早于人至猴移植[5]，异种异体移植的反应强于同种异体移植。主要是细胞介导的宿主迟发型超敏反应[25]的结果，而视网膜自身抗原特异性免疫抑制可免使移植物遭受排斥[9]。研究表明，MHC-Ⅱ是移植免疫中最主要的抗原，就人类而言则是白细胞抗原(HLA)，尽可能选用相同匹配的HLA，可减轻免疫排斥[7，27]。现在多用环孢霉素A(CsA)作为免疫抑制剂[28]。它是一种真菌多肽，选择性的作用于T淋巴细胞活化初期，抑制其产生干扰素和ITL-2的能力，进而抑制T细胞介导的细胞免疫而不致显著影响机体的一般防御能力。用后未见有免疫排斥现象，即使不用，人胎眼的RPE细胞也能在猴体内存活[26]。注意，免疫排斥反应可在二眼中同时出现[7]!提醒我们临床工作时，切勿忽视健眼的情况。当然，移植物的存活并发挥效应不仅仅取决于取材、手术、抗排斥，还要受制于病变性质、范围、程度以及脉络膜和视网膜神经上皮层的功能状态[19]。
, 百拇医药
目前的热点就在于移植免疫机制的研究以及免疫抑制剂的合理应用、视网膜下腔手术新的操作技术的发展和术后并发症的妥善处理等。
作者单位：张钧(上海第二医科大学附属新华医院 200092)
盛耀华(上海第二医科大学附属新华医院 200092)
参考文献
1，李凤鸣.眼科全书[M].北京：人民卫生出版社 1996∶332-553.
2，Green WR.Clinicopathologic studies of treated choroidal neovascular membranes.A review and report of two years[J].Retina 1991;11∶328-356.
, 百拇医药
3，Macular Photocoagulation Study Group.Laser photocoagulation of subfoveal neovascular lesions in age-related macular degeneration.Results of a randomized clinical trial[J].Arch Ophthalmol 1991;109∶1220-1231.
4，Gouras P,Flood MT,Kjedbye H,et al.Transplantation of cultured human retinal epithelium to Bruch's membrane of the owl monkey's eye[J].Curr Eye Res 1985;4∶253-265.
5，Sheng Y,Gouras P,Cao H,et al.Patch transplants of human fetal retinal pigment epithelium in rabbit and monkey retina[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1995;36∶381-390.
, 百拇医药
6，Lopez R,Gouras P,Brittis M,et al.Transplanted retinal pigment epithelium modifies the retinal degeneration in the RCS rat[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1989;30(suppl)∶209.
7，Tamai M.Retinal pigment epithelial cell transplantation：perspective[J].Nippon Ganka Gakkai Zasshi 1996;12∶982-1006.
8，Algvere PV,Berglin L,Gouras P,et al.Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 1994;232∶707-716.
, 百拇医药
9，Wongpichedchai S,Weiter JJ,Weber P,et al.Comparison of external and internal approaches for transplantation of autologous retinal pigment epithelium[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1992;33∶3341-3352.
10，Richard G,Weckerle P.Transplantation of retinal components[J].Klin Monatsbl Augenheilkd 1995;2∶71-77.
11，Dirini AA,Wang HM,Ogden TE,et al.Retinal pigment epithelium implantation in the rabbit： technique and morphology[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 1992;230∶292-300.
, http://www.100md.com
12，Sheedlo HJ,Li L,Turner JE.Effects of RPE age and culture conditions on support of photoreceptor cell survival in transplanted RCS dystrophic rats[J].Exp Eye Res 1993;6∶753-761.
13，Li L,Turner JE.Optimal conditions for long-term photoreceptor cell rescue in RCS rats: the necessity for healthy RPE transplants[J].Exp Eye Res 1991;52∶669-679.
14，Lin N,Fan W,Sheedlo HJ,et al.Photoreceptor repair in response to RPE transplants in RCS rats:outer segment regeneration[J].Curr Eye Res 1996;10∶1069-1077.
, 百拇医药
15，Gouras P,Lopez R,Brittis M,et al.The ultrastructure of transplanted rabbit retinal epithelium[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 1992;230∶468-475.
16，Jiang LQ,Hamasaki D.Corneal electroretinographic function rescued by normal retinal pigment epithelial grafts in retinal degenerative Royal College of Surgeons rats[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1994;13∶4300-4309.
17，Yamamoto S,Du J,Gouras P,et al.Retinal pigment epithelial transplants and retinal function in RCS rats[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1993;34∶3068-3075.
, http://www.100md.com
18，Gouras P,Algvere P.Retinal cell transplantation in the macular∶new techniques[J].Vision Res 1996;24∶4121-4125.
19，Grierson I,Hiscott P,Hogg P,et al.Development,repair and regeneration of the retinal pigment epithelium[J].Eye 1994;8(Pt2)∶255-262.
20，Takeda Y,Yamaguchi K,Yamada K,et al.S-antigen in retinas of Royal College of Surgeons rats∶time course and retinal pigment epithelium transplant study[J].Nippon Ganka Gakkai Zasshi 1994；6∶551-557.
, 百拇医药
21，Seaton AD,Sheedlo HJ,Turner JE.A primary role for RPE transplants in the inhibition and regression of neovascularization in the RCS rat [J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1994;35∶162-169.
22，Sheedlo HJ,Li L,Barnstable CJ,et al.Synaptic and photoreceptor components in retinal pigment epithelial cell transplanted retinas of Royal College of Surgeons dystrophic rats[J].J Neurosci Res 1993;4∶423-431.
23，Yamaguchi K,Gouras VP,Turner JE,et al.Retinal pigment epithelial cell transplantation into aging retina： a possible approach to delay age-related cell death[J].Jap J Ophthalmol 1993;1∶16-27.
, http://www.100md.com
24，Gaur V,Agarwail N,Li L,et al.Maintenance of opsin and S-antigen gene expression in RCS dystrophic rats following RPE transplantation[J].Exp Eye Res 1992;1∶91-101.
25，Jiang LQ,Jorquera M,Streilein JW,et al.Immunololgic consequences of intraocular implantation of retinal pigment epithelial allografts[J].Exp Eye Res 1994;6∶719-728.
26，Berglin L,Gouras P,Sheng Y,et al.Tolerance of human fetal retinal pigment epithelium xenografts in monkey retina[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 1997;235∶103-110.
27，Taylor CJ,Dyer PA.Histocompatibility antigens[J].Eye 1995;9∶173-179.
28，Little CW,Castillo B,Diloreto DA,et al.Transplantation of human retinal pigment epithelium rescues photoreceptor cells form degeneration in the Royal College of Surgeons rat retina[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1996;1∶204-211., 百拇医药
张钧 盛耀华
关键词：视网膜色素上皮；上皮细胞；细胞移植；免疫排斥；老年黄斑变性
视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)由排列规则的单层细胞构成，位于视网膜神经上皮层和Bruch膜之间，由于其特殊的解剖学位置，它在视网膜中起着重要的作用[1]。RPE、Bruch膜和脉络膜毛细血管的进行性病变可危及视网膜感光细胞，形成视网膜下的新生血管膜，比如老年黄斑变性(age-related macular degeneration,ARMD)。传统的光凝疗法预后不佳，尤其在黄斑区[2，3]。近年来成功开展了视网膜下膜的“剥膜”手术，由于同时丧失了RPE细胞，要求移植以作补充。由此带来了以下新课题：(1)RPE的取材与培养；(2)移植新技术的开展；(3)移植免疫机制的研究；(4)免疫抑制剂的应用；(5)术后并发症的处理。
, 百拇医药
1 实验方法
目前主要限于动物实验，包括：同种异体的灵长类、兔[4-6]；异种异体的人胎眼至兔、猴[5，7]；Algvere等曾进行过人胎眼至人的移植。首先用胰蛋白酶消化、分离RPE细胞，放入37℃的CO2培养箱2～3wk，取得材料。大多通过外路(穿透后巩膜途径)或内路(玻璃体-视网膜途径)2种方法[5，8-10]，将经培养的或原代的RPE细胞植入宿主的视网膜下腔。(1)外路法：分离并剪断上直肌，暴露近黄斑区的后巩膜，作厚近全层的巩膜瓣，用特制针头刺破其下的脉络膜约4mm，将RPE细胞注入视网膜下腔。本法植入的RPE细胞数量较多，一般不会造成医源孔，但操作难度较大，定位困难，开展不很成熟；(2)内路法：经睫状体扁平部的切口，先行玻璃体切割，再用特制针头刺破中央凹颞上方的视网膜，注入平衡液造成小范围的网脱，然后植入RPE细胞。本法是在直视下手术，较为精细、效果好，但易造成医源孔，而且如何处理视网膜注射孔也较麻烦，临床上一般要经气-液交换或注入硅油以封闭该孔[8]。有研究认为，移植同种的RPE细胞效果好于异种移植[7]，移植片状的RPE细胞效果好于游离的，移植年轻、健康的RPE细胞效果好于成年的[12](而且这一点被认为是必需的[13])，考虑极性移植的RPE细胞优于丧失极性者[5]。
, 百拇医药
2 动物实验
通过上述方法将RPE细胞植入视网膜下腔，单个或成串排列，一般在21d后与Bruch膜[14]和感光细胞外段接触，至少可存活3mo[8]。移植的RPE细胞能保持完整性、形态、色素达5mo之久[15]，并且还能挽救视网膜的功能，此点已被实验中的ERG证实[16，17]。在人至猴移植中，通过电镜发现[15]：术后1wk脉络膜血管下出现单核细胞浸润，预示将有免疫排斥反应发生，术后1mo该反应变得明显；通过荧光造影还发现：术后7～9wk移植区域内无渗漏，晚期在相应黄斑水肿的部位出现荧光。慢性渗漏大多发生在湿型ARMD病例，而很少见于干型ARMD者[18]。同种异体移植的反应轻于异种异体移植。有人认为植入的RPE细胞会演变成纤维母细胞和巨噬细胞，但同样有人认为它们仅仅是形态上相象而已，并非真正转变[19]。目前主要借助普通眼底镜、扫描激光眼底镜(SLO)、荧光造影、微视野计进行随访观察。黄斑囊样水肿是主要的术后并发症，可造成视力骤降[8]。原因是宿主移植免疫排斥反应和手术机械性创伤所致。
, 百拇医药
3 植入RPE的作用
大量的动物实验表明[13，14，17-22]，移植后的RPE细胞能：(1)挽救感光细胞，维持其完整性(特别是外段)；(2)有助于失活的视网膜保持S抗原并延缓mRNA的降解；(3)防止视网膜新生血管的产生、正常血管的萎缩并保持其内平衡；(4)维持传导过程中膜整合蛋白的基因表达和合成；(5)通过吞噬作用去除碎片；(6)再建感光细胞的细胞间质、维持外丛状层的突触联系，延缓内外核层细胞的衰老；(7)分泌某种营养因子。
4 移植免疫
现已充分表明，视网膜下腔是一个免疫赦免部位，但不是绝对的和静止的[25]。血-视网膜屏障的破坏可造成慢性排斥反应[18]，中心凹区强于周边部[26]，人至兔移植强于、早于人至猴移植[5]，异种异体移植的反应强于同种异体移植。主要是细胞介导的宿主迟发型超敏反应[25]的结果，而视网膜自身抗原特异性免疫抑制可免使移植物遭受排斥[9]。研究表明，MHC-Ⅱ是移植免疫中最主要的抗原，就人类而言则是白细胞抗原(HLA)，尽可能选用相同匹配的HLA，可减轻免疫排斥[7，27]。现在多用环孢霉素A(CsA)作为免疫抑制剂[28]。它是一种真菌多肽，选择性的作用于T淋巴细胞活化初期，抑制其产生干扰素和ITL-2的能力，进而抑制T细胞介导的细胞免疫而不致显著影响机体的一般防御能力。用后未见有免疫排斥现象，即使不用，人胎眼的RPE细胞也能在猴体内存活[26]。注意，免疫排斥反应可在二眼中同时出现[7]!提醒我们临床工作时，切勿忽视健眼的情况。当然，移植物的存活并发挥效应不仅仅取决于取材、手术、抗排斥，还要受制于病变性质、范围、程度以及脉络膜和视网膜神经上皮层的功能状态[19]。
, 百拇医药
目前的热点就在于移植免疫机制的研究以及免疫抑制剂的合理应用、视网膜下腔手术新的操作技术的发展和术后并发症的妥善处理等。
作者单位：张钧(上海第二医科大学附属新华医院 200092)
盛耀华(上海第二医科大学附属新华医院 200092)
参考文献
1，李凤鸣.眼科全书[M].北京：人民卫生出版社 1996∶332-553.
2，Green WR.Clinicopathologic studies of treated choroidal neovascular membranes.A review and report of two years[J].Retina 1991;11∶328-356.
, 百拇医药
3，Macular Photocoagulation Study Group.Laser photocoagulation of subfoveal neovascular lesions in age-related macular degeneration.Results of a randomized clinical trial[J].Arch Ophthalmol 1991;109∶1220-1231.
4，Gouras P,Flood MT,Kjedbye H,et al.Transplantation of cultured human retinal epithelium to Bruch's membrane of the owl monkey's eye[J].Curr Eye Res 1985;4∶253-265.
5，Sheng Y,Gouras P,Cao H,et al.Patch transplants of human fetal retinal pigment epithelium in rabbit and monkey retina[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1995;36∶381-390.
, 百拇医药
6，Lopez R,Gouras P,Brittis M,et al.Transplanted retinal pigment epithelium modifies the retinal degeneration in the RCS rat[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1989;30(suppl)∶209.
7，Tamai M.Retinal pigment epithelial cell transplantation：perspective[J].Nippon Ganka Gakkai Zasshi 1996;12∶982-1006.
8，Algvere PV,Berglin L,Gouras P,et al.Transplantation of fetal retinal pigment epithelium in age-related macular degeneration with subfoveal neovascularization[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 1994;232∶707-716.
, 百拇医药
9，Wongpichedchai S,Weiter JJ,Weber P,et al.Comparison of external and internal approaches for transplantation of autologous retinal pigment epithelium[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1992;33∶3341-3352.
10，Richard G,Weckerle P.Transplantation of retinal components[J].Klin Monatsbl Augenheilkd 1995;2∶71-77.
11，Dirini AA,Wang HM,Ogden TE,et al.Retinal pigment epithelium implantation in the rabbit： technique and morphology[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 1992;230∶292-300.
, http://www.100md.com
12，Sheedlo HJ,Li L,Turner JE.Effects of RPE age and culture conditions on support of photoreceptor cell survival in transplanted RCS dystrophic rats[J].Exp Eye Res 1993;6∶753-761.
13，Li L,Turner JE.Optimal conditions for long-term photoreceptor cell rescue in RCS rats: the necessity for healthy RPE transplants[J].Exp Eye Res 1991;52∶669-679.
14，Lin N,Fan W,Sheedlo HJ,et al.Photoreceptor repair in response to RPE transplants in RCS rats:outer segment regeneration[J].Curr Eye Res 1996;10∶1069-1077.
, 百拇医药
15，Gouras P,Lopez R,Brittis M,et al.The ultrastructure of transplanted rabbit retinal epithelium[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 1992;230∶468-475.
16，Jiang LQ,Hamasaki D.Corneal electroretinographic function rescued by normal retinal pigment epithelial grafts in retinal degenerative Royal College of Surgeons rats[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1994;13∶4300-4309.
17，Yamamoto S,Du J,Gouras P,et al.Retinal pigment epithelial transplants and retinal function in RCS rats[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1993;34∶3068-3075.
, http://www.100md.com
18，Gouras P,Algvere P.Retinal cell transplantation in the macular∶new techniques[J].Vision Res 1996;24∶4121-4125.
19，Grierson I,Hiscott P,Hogg P,et al.Development,repair and regeneration of the retinal pigment epithelium[J].Eye 1994;8(Pt2)∶255-262.
20，Takeda Y,Yamaguchi K,Yamada K,et al.S-antigen in retinas of Royal College of Surgeons rats∶time course and retinal pigment epithelium transplant study[J].Nippon Ganka Gakkai Zasshi 1994；6∶551-557.
, 百拇医药
21，Seaton AD,Sheedlo HJ,Turner JE.A primary role for RPE transplants in the inhibition and regression of neovascularization in the RCS rat [J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1994;35∶162-169.
22，Sheedlo HJ,Li L,Barnstable CJ,et al.Synaptic and photoreceptor components in retinal pigment epithelial cell transplanted retinas of Royal College of Surgeons dystrophic rats[J].J Neurosci Res 1993;4∶423-431.
23，Yamaguchi K,Gouras VP,Turner JE,et al.Retinal pigment epithelial cell transplantation into aging retina： a possible approach to delay age-related cell death[J].Jap J Ophthalmol 1993;1∶16-27.
, http://www.100md.com
24，Gaur V,Agarwail N,Li L,et al.Maintenance of opsin and S-antigen gene expression in RCS dystrophic rats following RPE transplantation[J].Exp Eye Res 1992;1∶91-101.
25，Jiang LQ,Jorquera M,Streilein JW,et al.Immunololgic consequences of intraocular implantation of retinal pigment epithelial allografts[J].Exp Eye Res 1994;6∶719-728.
26，Berglin L,Gouras P,Sheng Y,et al.Tolerance of human fetal retinal pigment epithelium xenografts in monkey retina[J].Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 1997;235∶103-110.
27，Taylor CJ,Dyer PA.Histocompatibility antigens[J].Eye 1995;9∶173-179.
28，Little CW,Castillo B,Diloreto DA,et al.Transplantation of human retinal pigment epithelium rescues photoreceptor cells form degeneration in the Royal College of Surgeons rat retina[J].Invest Ophthalmol Vis Sci 1996;1∶204-211., 百拇医药