碘标记直肠癌相关抗原单克隆抗体的免疫显像研究*
碘标记直肠癌相关抗原单克隆抗体的免疫显像研究*
山东烟台毓璜顶医院(264000) 杨希谦 李建远 刘奉立
山东荷泽医专 刘粤梅
山东菏泽地区医院 杨爱景
提 要：采用非放射碘标记人直肠癌相关抗原单克隆抗体(McAb)进行肿瘤的免疫组化鉴定与免疫显像研究。应用本室制备的人直肠癌细胞相关抗原McAb，采用氯胺T法进行碘标记。经Sephadex G-10柱层析纯化，并进行免疫荧光鉴定及CT显像研究。直肠癌细胞与碘标记直肠癌单克隆抗体免疫结合后，在荧光显微镜下直肠癌细胞膜上出现鲜艳的桔黄色荧光，经CT扫描发现有阻挡X线作用，比对照管密度高出44HU，注入小鼠肝脏后，可见肝内有密度升高处，较正常肝组织高出14HU，能特异地标识出直肠癌细胞部位。结果提示：非放射碘标记人直肠癌相关抗原McAb可用于人直肠癌的免疫学诊断与生物导向CT显像研究。
, 百拇医药
关键词：直肠癌；单克隆抗体；免疫组织化学；碘化钠；肛肠病
放射免疫显像(RII)在医学研究中得到广泛应用，但RII存在同位素半衰期短、污染环境、需要专门配备ν照相机或ECT机等不足，为弥补RII的缺点，开发非放射碘的应用领域，进行了本项研究。
1 材料 人直肠癌相关抗原McAb(HM93-4McAb)和人直肠癌细胞株(HM93-4)，由本实验室制备。FITC-羊抗小鼠IgG,由军事医学科学院微生物流行病研究所提供。碘化钠溶液(10g/L)：碘化钠(AR)1.0g，加0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)至100ml。偏重亚硫酸钠溶液(30g/L)：偏理业硫酸钠(AR)3.0g，加0.05mol/L磷酸盐缓冲液(7.4)至100ml。Sephadex G-10和透析袋分别由Sweden和Sigma公司提供。二氧化碳培养箱(日本三洋公司)，倒置显微镜(上海光学仪器厂)，洁净工作台(北京净化设备厂)，低温离心机(法国乔恩公司)，蛋白柱层析紫外检测仪(北京新技术开发公司)，BSZ-160自动收集仪(上海沪西仪器厂)，放射荧光显微镜(美国AO公司)。
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1.2 方法
1.2.1 人直肠癌细胞(McAb免疫原细胞)的制备：取直肠癌标本分离细胞，在RPMI1640培养液中传代，1:1胰酶和EDTA消化，无血清1640制备细胞悬液，离心弃上清，加生理盐水，配成细胞悬液。
1.2.2 HM93-4McAb细胞株的制备[1]：取人直肠癌细胞免疫BaIb/c小鼠，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，经筛选鉴定获得特异性较强的能稳定分泌McAb的细胞株。
1.2.3 HM93-4McAb与直肠癌细胞间接免疫荧光试验(IFAT)[2，3]：取直肠癌细胞1×106/ml 0.5ml加入HM93-4McAb 0.1ml，37℃30min，用0.1mol/LpH7.4的PBS洗涤3次，去上清后加入PBS至0.5ml，取0.1ml滴载玻片上，用盖玻片加无荧光甘油封片在荧光显微镜下观测，结果照相。
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1.2.4 碘标记HM93-4McAb(I-McAb)：采用氯胺T法标记[4，5]：取试管1支，加入直肠癌McAb(小鼠腹水，抗体效价1:200)100μl，再加入NaI溶液(10g/L)0.5ml，震荡混匀后，各加氯胺T溶液100μl(10g/L,新鲜配制)，反应1min后，加入偏重亚硫酸钠溶液10μl(30g/L)终止反应，然后加入10%KI溶液1～2滴，无黄色出现，表示反应终止完全，将此样品进行纯化。
1.2.5 I-McAb的分离与纯化：取sephadex G-10 5g,蒸馏水浸泡过夜后，洗数次后装注，观察柱内无断层、无气泡后，用0.14mol/LNaCI-0.05mol/L PBS(pH7.4)平衡，连接蛋白质紫外检测仪，波长280nm。先通过牛血清蛋白溶液(10g/L)以封闭凝胶可能与蛋白质产生吸附的活性部位，待检测仪数字下降至0时，再加入I-McAb样品液，并用缓冲液洗脱，分段收集，每管1ml；将峰1收集液装入透析袋，聚乙二醇10倍浓缩，PBS透析。为1次制备量，制备5次混合待鉴定与实验用。
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1.2.6 I-McAb与直肠癌细胞间接免疫荧光试验：试验管(I-McAb与直肠癌细胞)与对照管(未经碘标记McAb与直肠癌细胞)同时进行IFAT，方法同1.2.3[6]。
1.2.7 I-McAb与直肠癌细胞结合后对X线的阻挡情况：取试管4只，管1加入未经碘标记McAb溶液0.6ml，管3加入McAb与直肠癌细胞免疫结合后的细胞悬液0.6ml(1×106/ml)，管4(实验组)加入I-McAb与直肠癌细胞免疫结合后的细胞悬液0.6ml(制备方法同免疫荧光实验)，将4管同置一试管架上，作CT扫描。
1.2.8 动物实验鉴定：取小鼠2只，在1号鼠(实验鼠)肝内注射I-McAb与直肠癌细胞结合的细胞悬液0.3ml(1×108/ml),2号鼠肝内注射直肠癌细胞悬液0.3ml(1×108/ml)。将2只小鼠背靠背排列固定，CT扫描，观察结果。
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2 结果
2.1 I-McAb直肠癌细胞免疫荧光试验(IFA) 在荧光显微镜下(AOZ073黄色滤光片)实验管直肠癌细胞膜上出现鲜艳的桔黄色(图1)，对照管在荧光显微镜下出现黄绿色荧光。
图1 I-McAb与直肠癌细胞(免疫原细胞株)免疫结合荧光显微镜
下观察直肠癌细胞膜上出现鲜艳的橘黄色荧光(×40)
2.2 I-McAb与直肠癌细胞结合后对X线的阻挡情况 CT扫描可见管2密度为139HU，管1的密度为32HU，管2比管1的密度高出107HU；管4密度为82HU，管3密度为38HU，管4比管3的密度高出44HU，实验管与对照管在CT图像上的密度有显著差异。
2.3 动物试验鉴定 CT扫描可见1号鼠(实验鼠)肝内有一密度升高处(图2箭头所指)，较正常肝组织(61HU)增高14HU，说明该部位有碘标记直肠癌细胞聚集。2号鼠(对照鼠)肝内注射癌细胞处，密度无明显变化，病灶不易识别。
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图2 肝脏附近连续四个层面CT扫描图像对照
其中第2层面显示对照鼠肝脏较好，第3层面显示实验鼠肝脏较好。
对照鼠肝内注射部位未见异常密度影。
而实验鼠肝脏内可见沿注射针道分布的条索状高密度影。
3 讨论
通过非放射碘标记McAb与直肠癌细胞免疫结合的实验研究，发现非放射I-McAb与直肠癌细胞膜结合后在荧光显微镜下出现鲜艳的桔黄色荧光，未经碘标记McAb与直肠癌细胞免疫结合后荧光显微镜下出现黄绿色荧光，这种现象可为非放射碘标记McAb的鉴定提供了一项指标。
非放射I-McAb与直肠癌细胞免疫结合后的细胞悬液，经CT扫描比对照组的密度高出44HU。CT扫描可见实验鼠(肝内注射I-McAb结合直肠癌细胞)肝内有一定密度升高处，比对照鼠(肝内注射直肠癌细胞)肝组织密度增高14HU，表明该部位有I-McAb直肠癌细胞聚集，使局部密度升高特异地标识出病变部位。实验结果表明；I-McAb与直肠癌细胞免疫结合后的细胞悬液能引起CT图像密度的改变。
该项研究的成果可应用于直肠癌免疫病理诊断与分型研究，同时也为非放射I-McAb用于临床肿瘤的生物导向免疫造影，CT显像诊断研究奠定了基础。
参考文献(略), 百拇医药
山东烟台毓璜顶医院(264000) 杨希谦 李建远 刘奉立
山东荷泽医专 刘粤梅
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提 要：采用非放射碘标记人直肠癌相关抗原单克隆抗体(McAb)进行肿瘤的免疫组化鉴定与免疫显像研究。应用本室制备的人直肠癌细胞相关抗原McAb，采用氯胺T法进行碘标记。经Sephadex G-10柱层析纯化，并进行免疫荧光鉴定及CT显像研究。直肠癌细胞与碘标记直肠癌单克隆抗体免疫结合后，在荧光显微镜下直肠癌细胞膜上出现鲜艳的桔黄色荧光，经CT扫描发现有阻挡X线作用，比对照管密度高出44HU，注入小鼠肝脏后，可见肝内有密度升高处，较正常肝组织高出14HU，能特异地标识出直肠癌细胞部位。结果提示：非放射碘标记人直肠癌相关抗原McAb可用于人直肠癌的免疫学诊断与生物导向CT显像研究。
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关键词：直肠癌；单克隆抗体；免疫组织化学；碘化钠；肛肠病
放射免疫显像(RII)在医学研究中得到广泛应用，但RII存在同位素半衰期短、污染环境、需要专门配备ν照相机或ECT机等不足，为弥补RII的缺点，开发非放射碘的应用领域，进行了本项研究。
1 材料 人直肠癌相关抗原McAb(HM93-4McAb)和人直肠癌细胞株(HM93-4)，由本实验室制备。FITC-羊抗小鼠IgG,由军事医学科学院微生物流行病研究所提供。碘化钠溶液(10g/L)：碘化钠(AR)1.0g，加0.05mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)至100ml。偏重亚硫酸钠溶液(30g/L)：偏理业硫酸钠(AR)3.0g，加0.05mol/L磷酸盐缓冲液(7.4)至100ml。Sephadex G-10和透析袋分别由Sweden和Sigma公司提供。二氧化碳培养箱(日本三洋公司)，倒置显微镜(上海光学仪器厂)，洁净工作台(北京净化设备厂)，低温离心机(法国乔恩公司)，蛋白柱层析紫外检测仪(北京新技术开发公司)，BSZ-160自动收集仪(上海沪西仪器厂)，放射荧光显微镜(美国AO公司)。
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1.2 方法
1.2.1 人直肠癌细胞(McAb免疫原细胞)的制备：取直肠癌标本分离细胞，在RPMI1640培养液中传代，1:1胰酶和EDTA消化，无血清1640制备细胞悬液，离心弃上清，加生理盐水，配成细胞悬液。
1.2.2 HM93-4McAb细胞株的制备[1]：取人直肠癌细胞免疫BaIb/c小鼠，取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，经筛选鉴定获得特异性较强的能稳定分泌McAb的细胞株。
1.2.3 HM93-4McAb与直肠癌细胞间接免疫荧光试验(IFAT)[2，3]：取直肠癌细胞1×106/ml 0.5ml加入HM93-4McAb 0.1ml，37℃30min，用0.1mol/LpH7.4的PBS洗涤3次，去上清后加入PBS至0.5ml，取0.1ml滴载玻片上，用盖玻片加无荧光甘油封片在荧光显微镜下观测，结果照相。
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1.2.4 碘标记HM93-4McAb(I-McAb)：采用氯胺T法标记[4，5]：取试管1支，加入直肠癌McAb(小鼠腹水，抗体效价1:200)100μl，再加入NaI溶液(10g/L)0.5ml，震荡混匀后，各加氯胺T溶液100μl(10g/L,新鲜配制)，反应1min后，加入偏重亚硫酸钠溶液10μl(30g/L)终止反应，然后加入10%KI溶液1～2滴，无黄色出现，表示反应终止完全，将此样品进行纯化。
1.2.5 I-McAb的分离与纯化：取sephadex G-10 5g,蒸馏水浸泡过夜后，洗数次后装注，观察柱内无断层、无气泡后，用0.14mol/LNaCI-0.05mol/L PBS(pH7.4)平衡，连接蛋白质紫外检测仪，波长280nm。先通过牛血清蛋白溶液(10g/L)以封闭凝胶可能与蛋白质产生吸附的活性部位，待检测仪数字下降至0时，再加入I-McAb样品液，并用缓冲液洗脱，分段收集，每管1ml；将峰1收集液装入透析袋，聚乙二醇10倍浓缩，PBS透析。为1次制备量，制备5次混合待鉴定与实验用。
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1.2.6 I-McAb与直肠癌细胞间接免疫荧光试验：试验管(I-McAb与直肠癌细胞)与对照管(未经碘标记McAb与直肠癌细胞)同时进行IFAT，方法同1.2.3[6]。
1.2.7 I-McAb与直肠癌细胞结合后对X线的阻挡情况：取试管4只，管1加入未经碘标记McAb溶液0.6ml，管3加入McAb与直肠癌细胞免疫结合后的细胞悬液0.6ml(1×106/ml)，管4(实验组)加入I-McAb与直肠癌细胞免疫结合后的细胞悬液0.6ml(制备方法同免疫荧光实验)，将4管同置一试管架上，作CT扫描。
1.2.8 动物实验鉴定：取小鼠2只，在1号鼠(实验鼠)肝内注射I-McAb与直肠癌细胞结合的细胞悬液0.3ml(1×108/ml),2号鼠肝内注射直肠癌细胞悬液0.3ml(1×108/ml)。将2只小鼠背靠背排列固定，CT扫描，观察结果。
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2 结果
2.1 I-McAb直肠癌细胞免疫荧光试验(IFA) 在荧光显微镜下(AOZ073黄色滤光片)实验管直肠癌细胞膜上出现鲜艳的桔黄色(图1)，对照管在荧光显微镜下出现黄绿色荧光。
图1 I-McAb与直肠癌细胞(免疫原细胞株)免疫结合荧光显微镜
下观察直肠癌细胞膜上出现鲜艳的橘黄色荧光(×40)
2.2 I-McAb与直肠癌细胞结合后对X线的阻挡情况 CT扫描可见管2密度为139HU，管1的密度为32HU，管2比管1的密度高出107HU；管4密度为82HU，管3密度为38HU，管4比管3的密度高出44HU，实验管与对照管在CT图像上的密度有显著差异。
2.3 动物试验鉴定 CT扫描可见1号鼠(实验鼠)肝内有一密度升高处(图2箭头所指)，较正常肝组织(61HU)增高14HU，说明该部位有碘标记直肠癌细胞聚集。2号鼠(对照鼠)肝内注射癌细胞处，密度无明显变化，病灶不易识别。
, http://www.100md.com
图2 肝脏附近连续四个层面CT扫描图像对照
其中第2层面显示对照鼠肝脏较好，第3层面显示实验鼠肝脏较好。
对照鼠肝内注射部位未见异常密度影。
而实验鼠肝脏内可见沿注射针道分布的条索状高密度影。
3 讨论
通过非放射碘标记McAb与直肠癌细胞免疫结合的实验研究，发现非放射I-McAb与直肠癌细胞膜结合后在荧光显微镜下出现鲜艳的桔黄色荧光，未经碘标记McAb与直肠癌细胞免疫结合后荧光显微镜下出现黄绿色荧光，这种现象可为非放射碘标记McAb的鉴定提供了一项指标。
非放射I-McAb与直肠癌细胞免疫结合后的细胞悬液，经CT扫描比对照组的密度高出44HU。CT扫描可见实验鼠(肝内注射I-McAb结合直肠癌细胞)肝内有一定密度升高处，比对照鼠(肝内注射直肠癌细胞)肝组织密度增高14HU，表明该部位有I-McAb直肠癌细胞聚集，使局部密度升高特异地标识出病变部位。实验结果表明；I-McAb与直肠癌细胞免疫结合后的细胞悬液能引起CT图像密度的改变。
该项研究的成果可应用于直肠癌免疫病理诊断与分型研究，同时也为非放射I-McAb用于临床肿瘤的生物导向免疫造影，CT显像诊断研究奠定了基础。
参考文献(略), 百拇医药