直肠癌及其远端癌旁粘膜中PCNA和P53蛋白的表达*
直肠癌及其远端癌旁粘膜中PCNA和P53蛋白的表达*
河南省焦作市人民医院外一科(4504151) 苗新泉
中国医科大学第一临床学院普三科 张 强 高克昌 王新文
提 要：应用免疫组化技术对21例直肠癌癌灶及其远端癌旁粘膜的增殖细胞核抗原(PCNA)和P53蛋白表达情况进行探讨。结果表明，癌灶PCNA标记指数(PCNA LI)明显高于癌旁粘膜；癌旁粘膜中距癌灶愈近，PCNA LI愈高，且在距癌灶3cm处已明显降低；57%的癌灶和38%的癌旁粘膜有P53蛋白的表达，且癌旁粘膜中P53蛋白阳性距离均不超过癌灶下缘3cm；PCNA和P53蛋白的表达呈正相关；癌灶的PCNA和P53蛋白表达及癌旁粘膜的PCNA表达均与Dukes分期无相关性，但癌旁粘膜的P53蛋白表达与Dukes分期明显相关。认为P53基因改变参与了直肠癌的发病过程；癌旁移行粘膜的性质，起初是对癌灶的反应性变化，进而逐渐恶性化，最终可转变成癌；直肠癌根治术中远端肠管切除3cm长较为合理。
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关键词：直肠癌；癌旁粘膜；增殖细胞核抗原；P53蛋白；肛肠病
在保留肛管括约肌的直肠癌根治术中，确定远端肠管的合理切除长度至关重要，而癌旁粘膜的性质及其病变范围是决定切除长度的关键因素，但对些至今尚无定论。增殖细胞核抗原(PCNA)是近年发现的能较好地反映细胞增殖的生物学指标，P53基因改变在直肠癌的发生中具有重要地位。本研究应用免疫组化技术检测PCNA和P53蛋白在直肠癌及其远端癌旁粘膜中的表达情况，以期为明确癌旁粘膜的性质及其病变范围提供有价值的资料。
1 材料与方法
1.1 临床材料 手术切除并经病理证实的21例直肠癌标本，男13例，女8例；年龄33～68岁。乳头状腺癌11例，管状腺癌8例，粘液腺癌2例。Dukes B期11例，C期10例。
, 百拇医药
1.2 标本处理 将切除之新鲜标本尽快于10%福尔马林液中固定22～26h，尔后分别在癌灶、距癌灶下缘1cm、2cm、3cm……处取宽1cm、厚2mm的组织块，制成蜡块，连续切片3张，厚度5μm。
1.3 染色 常规HE染色1张，免疫组织化学染色1张，方法为过氧化物酶标记的链霉卵白素法，即SP法。主要试剂有：SP试剂盒(ZYMED公司)，PCNA的单抗PC10(ZYMED公司)，P53蛋白的单抗P53(DO-1)(Santa Cruz公司)。
1.4 结果判定
1.4.1 PCNA阳性细胞判定：光镜下观察细胞核呈浅棕色、棕褐色或棕褐色颗粒状着色均定为阳性；用血细胞分类计数器取阳性细胞最密集的癌灶区域或纵切肠腺窝，计数1000个肿瘤细胞或粘膜上皮细胞中的PCNA阳性细胞数；按以下公式计算PCNA标记指数(PCNA LI)：
, 百拇医药
PCNA LI
=
1000个肿瘤细胞或肠腺窝上皮细胞中PCNA阳性细胞数
×
100%
1000
1.4.2 P53蛋白染色阳性判定：癌灶肿瘤细胞和癌旁粘膜上皮细胞中，核呈棕色或棕褐色颗粒状着色均为阳性，每张切片均由3人各自独立观察，至少两人结果一致为最终染色。
1.5 数据记录及处理 各部位PCNA标记指数x±s表示，相互比较用t检验；P53蛋白表达用阳性百分率，相互之间的比较用x2检验。
, 百拇医药 2 结果
2.1 癌灶与远端癌旁粘膜PCNA LI 癌灶的PCNA LI明显高于远端癌旁粘膜(P<0.01)；癌旁粘膜中，1cm、2cm处的PCNA LI高于3cm、4cm、5cm、6cm处(P<0.05)；后4者间的PCNA LI无统计学差异；1cm处PCNA LI略低于2cm处，但无统计学差异，见图1。
图1 癌灶及癌旁粘膜中PCNA LI
2.2 不同Dukes分期直肠癌PCNA LI 癌灶和癌旁粘膜的PCNA LI均和Dukes分期无相关性。
2.3 P53蛋白阳性表达情况 癌灶的P53蛋白阳性率为57%(12/21)，癌旁粘膜为38%(8/21)；P53蛋白阳性癌灶的癌旁粘膜中，阳性距离均在3cm以内，其中半数不超过2cm。
, 百拇医药
2.4 不同Dukes分期直肠癌的P53蛋白表达情况 Dukes B期和C期直肠癌，癌灶的P53蛋白阳性率分别为55%(6/11)、60%(6/10)，二者无显著差异；而癌旁粘膜的P53蛋白阳性率分别为18%(2/11)、60%(6/10)，二者差异显著(P<0.05)。
2.5 P53蛋白表达与PCNA LI P53蛋白阳性癌灶的PCNA LI高于阴性癌灶，阳性癌旁粘膜的PCNA LI也高于阴性癌旁粘膜(P<0.05)。
3 讨论
PCNA是和细胞周期的S期有关的核蛋白，其标记指数越高，提示增殖活性越高。本研究显示癌灶的PCNA LI高于癌旁粘膜，即癌灶的增殖活性明显高于远端癌旁粘膜。在远端癌旁粘膜中，距癌灶愈近，PCNA LI愈高，说明距癌灶越近癌旁粘膜的增殖活性越高。本研究还显示，距癌灶3cm处的远端癌旁粘膜的增殖活性已明显降低，3cm以下的直肠粘膜增殖活性基本正常。至于癌旁粘膜中PCNA表达增高的机制尚未阐明，可能为癌灶的旁分泌效应或癌浸润造成的局部粘膜微环境改变，导致PCNA mRNA稳定性增加，从而使PCNA表达增加[1]。
, 百拇医药
抑癌基因P53的突变见于75%以上的强求直肠肿瘤，50%～60%的结直肠癌有P53蛋白表达，为结直肠癌发生的一个相对晚期事件[2，3]。本组病例中癌灶的P53蛋白阳性率为57%，提示P53基因改变参与了直肠癌的发病过程。
正常直肠粘膜无P53蛋白的表达[2，4]。已有研究表明胰腺癌癌旁的非癌胰腺组织、宫颈癌癌旁上皮均无P53蛋白表达[5，6]。本研究发现38%直肠癌远端癌旁粘膜中有P53蛋白的表达，而且只有癌灶有P53蛋白表达时，其癌旁粘膜才有可能有P53蛋白的表达，P53蛋白阴性癌灶均未发现伴随有P53蛋白阳性的癌旁粘膜。同时，远端癌旁粘膜中的阳性距离均未超过3cm。Sun[4]等研究了19例结直肠癌的远端切缘，均无P53蛋白表达，推测是因为其所研究的远端切缘的粘膜，离癌灶的距离可能均超过3cm。
, 百拇医药
本研究表明癌灶及癌旁粘膜的PCNA LI、癌灶中P53蛋白表达均与Dukes分期呈正相关；可见癌旁粘膜的P53蛋白表达情况比癌灶中的P53蛋白表达情况更具有预后意义。
PCNA和P53蛋白二者在癌灶及癌旁粘膜中的表达均有相关性，P53蛋白阳性时，PCNA LI较高，提示二者关系密切。已有资料证明，P53蛋白对PCNA基因有调节作用，突变型P53蛋白可能直接激活PCNA启动子，从而引起PCNA表达增加[7]。
癌旁移行粘膜的性质至今尚有争论，有人认为是癌前病变，有人认为是对癌的反应性变化。本研究发现的癌旁粘膜PCNA表达增加和有P53蛋白表达可能对判定癌旁移行粘膜的性质具有重要意义。Hirano等[8]发现在支气管肺癌的发生过程中，首先为鳞状化生上皮从G0期细胞过渡为增殖细胞，PCNA表达增加，继而出现DNA非整倍体，后者反过来促使P53过度表达，而且已证实癌旁移行粘膜非整倍体DNA增多[9]，故推测直肠癌癌旁粘膜起初在癌灶的旁分泌效应或癌浸润造成的局部微环境改变等机制的作用下，其PCNA表达增加，增殖活性增高，继而导致DNA非整倍体增多，后者反过来促使P53过度表达；P53蛋白过度表达又反过来导致PCNA表达增加，从而形成恶性循环，最终使癌旁粘膜转变成癌，即癌旁移行粘膜起初是对癌灶的反应性变化，而后逐渐恶性化，最终转化为癌，也就是直肠癌诱导癌旁粘膜癌变的现象。
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故此，直肠癌根治术中必须除一定长度的远端肠管才能尽可能避免局部复发。根据本研究的结果，距离癌灶下缘3cm处的直肠粘膜增殖活性已明显降低，且远端癌旁粘膜中P53蛋白表达均限于3cm以内，故远端肠管切除3cm长较为合理。
参考文献
1.Jaskulski D,et al.J Biol Chem 1988；263：10175.
2.Pignatelli M,et al.Int J Cancer 1992；50：683.
3.Rodrigues NR,et al.Proc Natl Acad Sci USA 1990；97：7555.
4.Sun XF,et al.Lancet 1992；37：1369.
5.Digiuseppe JA,et al.Am J Clin Patho 1994；340：684.
6.Holm R,et al.J Pathol 1993；169：21.
7.Deb,et al.J Virol 1992；66：6164.
8.Hirano T,et al.Am J Pathol 1994：144：296.
9.王强，等.中华病理学杂志 1992；21：309., http://www.100md.com(直肠癌及其远端癌旁粘膜中PCNA和P53蛋白的表达*)
河南省焦作市人民医院外一科(4504151) 苗新泉
中国医科大学第一临床学院普三科 张 强 高克昌 王新文
提 要：应用免疫组化技术对21例直肠癌癌灶及其远端癌旁粘膜的增殖细胞核抗原(PCNA)和P53蛋白表达情况进行探讨。结果表明，癌灶PCNA标记指数(PCNA LI)明显高于癌旁粘膜；癌旁粘膜中距癌灶愈近，PCNA LI愈高，且在距癌灶3cm处已明显降低；57%的癌灶和38%的癌旁粘膜有P53蛋白的表达，且癌旁粘膜中P53蛋白阳性距离均不超过癌灶下缘3cm；PCNA和P53蛋白的表达呈正相关；癌灶的PCNA和P53蛋白表达及癌旁粘膜的PCNA表达均与Dukes分期无相关性，但癌旁粘膜的P53蛋白表达与Dukes分期明显相关。认为P53基因改变参与了直肠癌的发病过程；癌旁移行粘膜的性质，起初是对癌灶的反应性变化，进而逐渐恶性化，最终可转变成癌；直肠癌根治术中远端肠管切除3cm长较为合理。
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关键词：直肠癌；癌旁粘膜；增殖细胞核抗原；P53蛋白；肛肠病
在保留肛管括约肌的直肠癌根治术中，确定远端肠管的合理切除长度至关重要，而癌旁粘膜的性质及其病变范围是决定切除长度的关键因素，但对些至今尚无定论。增殖细胞核抗原(PCNA)是近年发现的能较好地反映细胞增殖的生物学指标，P53基因改变在直肠癌的发生中具有重要地位。本研究应用免疫组化技术检测PCNA和P53蛋白在直肠癌及其远端癌旁粘膜中的表达情况，以期为明确癌旁粘膜的性质及其病变范围提供有价值的资料。
1 材料与方法
1.1 临床材料 手术切除并经病理证实的21例直肠癌标本，男13例，女8例；年龄33～68岁。乳头状腺癌11例，管状腺癌8例，粘液腺癌2例。Dukes B期11例，C期10例。
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1.2 标本处理 将切除之新鲜标本尽快于10%福尔马林液中固定22～26h，尔后分别在癌灶、距癌灶下缘1cm、2cm、3cm……处取宽1cm、厚2mm的组织块，制成蜡块，连续切片3张，厚度5μm。
1.3 染色 常规HE染色1张，免疫组织化学染色1张，方法为过氧化物酶标记的链霉卵白素法，即SP法。主要试剂有：SP试剂盒(ZYMED公司)，PCNA的单抗PC10(ZYMED公司)，P53蛋白的单抗P53(DO-1)(Santa Cruz公司)。
1.4 结果判定
1.4.1 PCNA阳性细胞判定：光镜下观察细胞核呈浅棕色、棕褐色或棕褐色颗粒状着色均定为阳性；用血细胞分类计数器取阳性细胞最密集的癌灶区域或纵切肠腺窝，计数1000个肿瘤细胞或粘膜上皮细胞中的PCNA阳性细胞数；按以下公式计算PCNA标记指数(PCNA LI)：
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PCNA LI
=
1000个肿瘤细胞或肠腺窝上皮细胞中PCNA阳性细胞数
×
100%
1000
1.4.2 P53蛋白染色阳性判定：癌灶肿瘤细胞和癌旁粘膜上皮细胞中，核呈棕色或棕褐色颗粒状着色均为阳性，每张切片均由3人各自独立观察，至少两人结果一致为最终染色。
1.5 数据记录及处理 各部位PCNA标记指数x±s表示，相互比较用t检验；P53蛋白表达用阳性百分率，相互之间的比较用x2检验。
, 百拇医药 2 结果
2.1 癌灶与远端癌旁粘膜PCNA LI 癌灶的PCNA LI明显高于远端癌旁粘膜(P<0.01)；癌旁粘膜中，1cm、2cm处的PCNA LI高于3cm、4cm、5cm、6cm处(P<0.05)；后4者间的PCNA LI无统计学差异；1cm处PCNA LI略低于2cm处，但无统计学差异，见图1。
图1 癌灶及癌旁粘膜中PCNA LI
2.2 不同Dukes分期直肠癌PCNA LI 癌灶和癌旁粘膜的PCNA LI均和Dukes分期无相关性。
2.3 P53蛋白阳性表达情况 癌灶的P53蛋白阳性率为57%(12/21)，癌旁粘膜为38%(8/21)；P53蛋白阳性癌灶的癌旁粘膜中，阳性距离均在3cm以内，其中半数不超过2cm。
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2.4 不同Dukes分期直肠癌的P53蛋白表达情况 Dukes B期和C期直肠癌，癌灶的P53蛋白阳性率分别为55%(6/11)、60%(6/10)，二者无显著差异；而癌旁粘膜的P53蛋白阳性率分别为18%(2/11)、60%(6/10)，二者差异显著(P<0.05)。
2.5 P53蛋白表达与PCNA LI P53蛋白阳性癌灶的PCNA LI高于阴性癌灶，阳性癌旁粘膜的PCNA LI也高于阴性癌旁粘膜(P<0.05)。
3 讨论
PCNA是和细胞周期的S期有关的核蛋白，其标记指数越高，提示增殖活性越高。本研究显示癌灶的PCNA LI高于癌旁粘膜，即癌灶的增殖活性明显高于远端癌旁粘膜。在远端癌旁粘膜中，距癌灶愈近，PCNA LI愈高，说明距癌灶越近癌旁粘膜的增殖活性越高。本研究还显示，距癌灶3cm处的远端癌旁粘膜的增殖活性已明显降低，3cm以下的直肠粘膜增殖活性基本正常。至于癌旁粘膜中PCNA表达增高的机制尚未阐明，可能为癌灶的旁分泌效应或癌浸润造成的局部粘膜微环境改变，导致PCNA mRNA稳定性增加，从而使PCNA表达增加[1]。
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抑癌基因P53的突变见于75%以上的强求直肠肿瘤，50%～60%的结直肠癌有P53蛋白表达，为结直肠癌发生的一个相对晚期事件[2，3]。本组病例中癌灶的P53蛋白阳性率为57%，提示P53基因改变参与了直肠癌的发病过程。
正常直肠粘膜无P53蛋白的表达[2，4]。已有研究表明胰腺癌癌旁的非癌胰腺组织、宫颈癌癌旁上皮均无P53蛋白表达[5，6]。本研究发现38%直肠癌远端癌旁粘膜中有P53蛋白的表达，而且只有癌灶有P53蛋白表达时，其癌旁粘膜才有可能有P53蛋白的表达，P53蛋白阴性癌灶均未发现伴随有P53蛋白阳性的癌旁粘膜。同时，远端癌旁粘膜中的阳性距离均未超过3cm。Sun[4]等研究了19例结直肠癌的远端切缘，均无P53蛋白表达，推测是因为其所研究的远端切缘的粘膜，离癌灶的距离可能均超过3cm。
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本研究表明癌灶及癌旁粘膜的PCNA LI、癌灶中P53蛋白表达均与Dukes分期呈正相关；可见癌旁粘膜的P53蛋白表达情况比癌灶中的P53蛋白表达情况更具有预后意义。
PCNA和P53蛋白二者在癌灶及癌旁粘膜中的表达均有相关性，P53蛋白阳性时，PCNA LI较高，提示二者关系密切。已有资料证明，P53蛋白对PCNA基因有调节作用，突变型P53蛋白可能直接激活PCNA启动子，从而引起PCNA表达增加[7]。
癌旁移行粘膜的性质至今尚有争论，有人认为是癌前病变，有人认为是对癌的反应性变化。本研究发现的癌旁粘膜PCNA表达增加和有P53蛋白表达可能对判定癌旁移行粘膜的性质具有重要意义。Hirano等[8]发现在支气管肺癌的发生过程中，首先为鳞状化生上皮从G0期细胞过渡为增殖细胞，PCNA表达增加，继而出现DNA非整倍体，后者反过来促使P53过度表达，而且已证实癌旁移行粘膜非整倍体DNA增多[9]，故推测直肠癌癌旁粘膜起初在癌灶的旁分泌效应或癌浸润造成的局部微环境改变等机制的作用下，其PCNA表达增加，增殖活性增高，继而导致DNA非整倍体增多，后者反过来促使P53过度表达；P53蛋白过度表达又反过来导致PCNA表达增加，从而形成恶性循环，最终使癌旁粘膜转变成癌，即癌旁移行粘膜起初是对癌灶的反应性变化，而后逐渐恶性化，最终转化为癌，也就是直肠癌诱导癌旁粘膜癌变的现象。
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故此，直肠癌根治术中必须除一定长度的远端肠管才能尽可能避免局部复发。根据本研究的结果，距离癌灶下缘3cm处的直肠粘膜增殖活性已明显降低，且远端癌旁粘膜中P53蛋白表达均限于3cm以内，故远端肠管切除3cm长较为合理。
参考文献
1.Jaskulski D,et al.J Biol Chem 1988；263：10175.
2.Pignatelli M,et al.Int J Cancer 1992；50：683.
3.Rodrigues NR,et al.Proc Natl Acad Sci USA 1990；97：7555.
4.Sun XF,et al.Lancet 1992；37：1369.
5.Digiuseppe JA,et al.Am J Clin Patho 1994；340：684.
6.Holm R,et al.J Pathol 1993；169：21.
7.Deb,et al.J Virol 1992；66：6164.
8.Hirano T,et al.Am J Pathol 1994：144：296.
9.王强，等.中华病理学杂志 1992；21：309., http://www.100md.com(直肠癌及其远端癌旁粘膜中PCNA和P53蛋白的表达*)