普罗布考对冠状动脉球囊损伤后管壁原癌基因c-myc表达的影响
http://www.100md.com
中国药学会
岳欣1， 潘其兴1， 李继福1， 张薇1，田奉正2，刘春生1 ，马道新1， 李贵双1 ，陈玉国1 ，于爱琴3 ，马玉林3，杨凯3
1 山东大学齐鲁医院心内科 济南，250012;
2 齐鲁制药厂药物研究所 济南，250012;
3 淄博市淄川区医院 淄博，255000
[摘要] 目的：通过建立猪冠状动脉球囊损伤模型，观察普罗布考对血管内膜增生及管壁原癌基因c-myc表达的影响。方法：选用雌性New Yorkshire良种猪19头，随机分为两组，对照组11头，普罗布考组8头，均行冠状动脉球囊扩张术，术后喂饲6周，重复冠状动脉造影后处死动物。普罗布考组于术前4周给予普罗布考1g, bid ,至实验结束。常规病理制片，观察形态学变化，采用RT-PCR的方法检测c-myc mRNA的表达强度。结果:对照组损伤动脉内膜可见大量平滑肌细胞增生，呈偏心性增厚，普罗布考组内膜增厚程度明显减低。对照组c-myc mRNA相对表达强度(2.73±0.51)明显高于正常动脉(0.82±0.09，P<0.05)，普罗布考组c-myc mRNA相对表达强度(1.44±0.25)较对照组减弱(P<0.05)，但仍高于正常动脉(P<0.05)。结论:普罗布考具有抑制冠状动脉球囊损伤后c-myc表达和内膜增生的作用。
, 百拇医药
[关键词] 普罗布考； 经皮经腔冠状动脉成形术；c-myc基因
[中图分类号] R972.6 [文献标识码] A [文章编号] 1003-3734(2001)-20010119
Effects of probucol on the expression of c-myc mRNA and neointimal hyperplasia after coronary angioplasty in a swine model
YUE xin1, PAN Qi-xing1, LI Ji-fu1, ZHANG Wei1, TIAN Feng-zheng2,LIU Chun-sheng1, MA Dao-xin1, LI Gui-shuang1, CHEN Yu-guo1, YU Ai-qin3, MA Yu-lin3, YANG Kai3
, 百拇医药
(1 Department of Cardiology, the QiLu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China;2 The QiLu pharmaceutical factory,Jinan 250000,China; 3 The Zichuan hospital, Zibo 255000,China)
[Abstract] Objective: To observe the effect of probucol on the expression of c-myc mRNA and neointimal hyperplasia after coronary angioplasty in a swine model. Methods: 19 female New Yorkshire pigs were randomly assigned to receive 2g.d-1 of probucol or control therapy for 4 weeks before percutaneous transluminal coronary angioplasty(PTCA),then PTCA was underwent in all the pigs, Probucol was continued until follow-up angiography 6 weeks after PTCA. Then the animals were killed and taken histopathologic examination. RT-PCR method was used to detect the expression of c-myc mRNA in the injured arteries. Results: The injured artery of the control group had eccentric hyperplastic neointima and the expression of the c-myc mRNA(2.73 0.51) was higher than the normal artery(0.820.09,P<0.05),The injured artery of the probucol group had less hyperplastic neointima and lower expression of the c-myc mRNA(1.440.25)than the control group(P<0.05),but higher than the normal artery(P<0.05).Conclusion: Probucol can decrease the expression of c-myc mRNA and the neointimal hyperplasia after PTCA.
, 百拇医药
[Key words] Probucol； Percutaneous transluminal coronary angioplasty； C-myc genes,近年的研究表明抗氧化剂普罗布考(probucol,丙丁酚)具有抑制经皮经腔冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)后再狭窄的作用[1]，但机制尚不清楚。本实验建立猪冠状动脉球囊损伤模型,观察普罗布考对损伤血管壁内原癌基因c-myc表达的影响，为其防治再狭窄提供依据。
材料与方法
1主要材料与试剂
普罗布考由齐鲁制药厂提供，批号951205；RNA提取试剂盒、PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司生产；RT-PCR试剂均购自美国Promega 公司。
, 百拇医药
2动物模型的制备
健康雌性New Yorkshire良种猪19只,体重(64±5)kg，随机分为对照组(n=11)和普罗布考组(n=8)。普罗布考组于术前4周开始给予普罗布考1g， bid，至实验结束。所有动物均于局麻下分离右侧股动脉,在X线透视下将8F JR 大腔引导导管插入左或右冠状动脉开口处,行冠状动脉造影,选用3.5～4mm的球囊置于左冠状动脉前降支中段,回旋支中段或右冠状动脉中远段,于8～10个大气压下扩张30s,放气1min,重复2或3次,球囊与管腔直径比约为1.1：1～1.3：1,重复冠状动脉造影,使管腔保持通畅。以另外一支未损伤的冠状动脉作为正常对照。术后结扎股动脉,缝合伤口。普通饲料喂养6周,重复行冠状动脉造影,静脉注射过量戊巴比妥钠处死动物。迅速取出心脏,分离冠状动脉,根据造影结果切取损伤段血管,选取一部分置10%中性福尔马林中固定,常规染色观察形态学变化；剩余部分封入1.5mL冻存管，置液氮中保存。
3损伤动脉壁内原癌基因c-myc mRNA的检测
, 百拇医药
采用RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)方法。
3.1 动脉壁组织RNA的提取 参照试剂盒说明书进行。
3.2 cDNA的合成 取提取的RNA 10μL，冰上依次加入Oligo dT(0.5μg.μL-1) 0.2μL,dNTP(10mmol.L-1) 2.5μL,M-MLV逆转录酶(200u. μL -1)0.5μL,RT 缓冲液(5×) 4μL ,RNA酶抑制剂(40u.μL-1 ) 0.5μL ,加DEPC(1%焦碳酸二乙酯)处理的三蒸水将总体积补至20μL 。37℃水浴30min,95℃放置10min以灭活M-MLV,0℃放置5min。置于-20℃备用。
3.3 PCR产物扩增 C-myc和GAPDH (3-磷酸甘油醛脱氢酶)的引物序列及扩增片段[2]如表1所示。取0.2mL离心管，以逆转录产物5μL 为模板，分别加入上游引物(50mmol?L -1)0.5μL ，下游引物(50mmol?L -1) 0.5μL，dNTP(10mmol?L -1 ) 1μL，Taq DNA聚合酶(5u?μL -1 ) 0.5μL，PCR 缓冲液(10×) 5μL，MgCl2(25mmol?L -1) 5μL，加三蒸水将总体积补至50μL。加入液体石蜡50μL，短暂离心混匀，放入PCR仪，95℃变性5min,然后按下述条件扩增35个循环：94℃45s,55℃45s,72℃45s，最后72℃延伸5 min。
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表1 引物序列及扩增片段
引物 引物序列 扩增片段
c-myc 上游5＇CCAAGCTCGTCTCAGAGAAG 3＇ 下游5＇AATTGTGCTGGTGCGTGGAC 5＇ 398bp
GAPDH 上游5＇CATCACCATCTTCCAGGAGCG 3＇ 下游5＇TGACCTTGCCCACAGCCTTG 3＇443bp
3.4 PCR产物的鉴定及定量分析 取PCR扩增产物10μL，与2μL上样缓冲液(6×)混匀，在2%琼脂糖凝胶中以5V.cm-1的电压电泳2h，紫外透射仪下观察，出现特异性条带为阳性。采用复日FR-980A生物电泳图像分析系统进行琼脂糖凝胶的扫描和扩增条带光密度分析。因为GAPDH在组织中稳定表达[2]，所以以GAPDH作为内参照，并按照下列公式计算c-myc 的相对表达强度：被测基因表达强度=被测基因光密度/GAPDH光密度。
, 百拇医药
4 统计学处理 采用EXCEL软件做统计学处理,所有数据以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用t检验，P<0.05表示有显著性差异。
结 果
1 常规形态学观察
实验中动物死亡5只,对照组4只, ,其中1只死于术后血栓形成,2只死于麻醉意外,1只于术中发生室颤致死；普罗布考组1只，死于术中室颤。术后所有存活动物恢复良好。
未损伤段冠状动脉柔软、有弹性,与周围组织无粘连；镜下内弹力板完整, 内膜和中膜无增生,平滑肌细胞排列规则,形态一致,细胞外基质少见。对照组损伤段动脉成灰白色,僵硬,与周围组织粘连；镜下可见内膜成偏心性增厚,主要由平滑肌细胞和胶原构成,此外尚可见泡沫细胞和少量的炎性细胞,内弹力板多处断裂, 中膜局部变薄,平滑肌细胞大量增生,排列紊乱无序。普罗布考组损伤段动脉与周围组织无明显的粘连；镜下内膜增厚程度明显减低。
, 百拇医药
2 对c-myc表达的影响
正常组、对照组和普罗布考组损伤动脉壁内c-myc mRNA的相对表达强度分别为(0.82±0.09),(2.73±0.51),(1.44±0.25)。对照组c-myc mRNA的表达明显高于正常动脉(P<0.05)；与对照组相比，普罗布考组c-myc mRNA表达减弱(P<0.05)，但仍高于正常动脉(P<0.05)。表明普罗布考可抑制损伤动脉壁原癌基因c-myc的表达。
讨 论
许多研究发现，血管平滑肌细胞(VSMC)增殖与原癌基因c-myc密切相关。C-myc基因表达增加，其编码蛋白与DNA结合，可促进与细胞增殖有关的基因开放，从而产生细胞增殖效应，提示c-myc基因的激活可能是VSMC增殖的始动因素。本研究发现，球囊损伤后6周，动脉壁c-myc表达强度明显高于正常动脉，进一步证实了c-myc在再狭窄中的重要作用。
, http://www.100md.com
普罗布考广泛应用于降血脂和抗氧化治疗。近来研究表明，它可以抑制平滑肌细胞的增殖和PTCA术后再狭窄的发生。Miyauchid等[3]的研究发现普罗布考可使球囊损伤的兔颈动脉内膜面积减少20%，内膜中VSMC的数目及PCNA(增殖细胞核抗原)阳性细胞显著减少，并降低血小板源生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)的表达，表明普罗布考抑制平滑肌细胞的增生及生长因子的表达。Watanabe 等[4]将118例行PTCA术的患者随机分成普罗布考治疗组(P组)和对照组，P组从术前7d开始服用普罗布考0.5g.d-1，术后3个月再次行冠状动脉造影，其残余管腔内径增加，再狭窄发生率下降。MVP (Multivitamins and Probucol Trial)试验和PART试验(the Probucol Angioplasty Restenosis Trial)也得到了相似的结果[1，5]。本实验亦证实普罗布考可抑制冠状动脉球囊损伤后内膜增生，并降低损伤动脉壁内c-myc表达强度，表明普罗布考可在一定程度上抑制c-myc的表达，可能是其防治再狭窄的机制之一。
, 百拇医药
[作者简介] 岳欣(1973-)，女，主治医师，主要研究方向为PTCA术后再狭窄的防治。 联系电话：(0531)8602498或(0531)6918375
[参 考 文 献]
[1] Tarif JC, Cote G, Lesperance J, et al. Probucol and multivitamins in the prevention of restenosis after coronary angioplasty[J].N Engl J Med,1997,337(6):365-372.
[2] Bartling B, Hoffmann J, Holtz, J, et al. Quantification of cardioprotective gene expression in porcine short-term hibernating myocardium[J]. J Mol Cell Cardiol, 1999, 31 (1):147-158.
, 百拇医药
[3] Miyauchi K,Aikawa M,Tani T, et al. Effect of probucol on smooth muscle cell proliferation and dedifferentiation after vascular injury in rabbits: possible role of PDGF[J]. Cardiovasc Drugs Ther,1998,12(3):251-260.
[4] Watanabe K, Sekiya M, Ikeda S, et al. Prevention effects of probucol on restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty[J].Am Heart J, 1996, 132(1 Pt 1):23-29.
[5] Yokoi H, Daida H, Kuwabara Y, et al. Effectiveness of antioxidant in preventing restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty: the probucol angioplasty restenosis trial[J]. J Am Coll Cardiol,1997,30(4):855-862.
, 百拇医药
扩增片段
c-myc 上游5＇CCAAGCTCGTCTCAGAGAAG 3＇ 下游5＇AATTGTGCTGGTGCGTGGAC 5＇ 398bp
GAPDH 上游5＇CATCACCATCTTCCAGGAGCG 3＇ 下游5＇ TGACCTTGCCCACAGCCTTG 3＇ 443bp
3.4 PCR产物的鉴定及定量分析 取PCR扩增产物10μL，与2μL上样缓冲液(6×)混匀，在2%琼脂糖凝胶中以5V.cm-1的电压电泳2h，紫外透射仪下观察，出现特异性条带为阳性。采用复日FR-980A生物电泳图像分析系统进行琼脂糖凝胶的扫描和扩增条带光密度分析。因为GAPDH在组织中稳定表达[2]，所以以GAPDH作为内参照，并按照下列公式计算c-myc 的相对表达强度：被测基因表达强度=被测基因光密度/GAPDH光密度。
4 统计学处理 采用EXCEL软件做统计学处理,所有数据以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用t检验，P<0.05表示有显著性差异。
摘自中国新药网, 百拇医药
1 山东大学齐鲁医院心内科 济南，250012;
2 齐鲁制药厂药物研究所 济南，250012;
3 淄博市淄川区医院 淄博，255000
[摘要] 目的：通过建立猪冠状动脉球囊损伤模型，观察普罗布考对血管内膜增生及管壁原癌基因c-myc表达的影响。方法：选用雌性New Yorkshire良种猪19头，随机分为两组，对照组11头，普罗布考组8头，均行冠状动脉球囊扩张术，术后喂饲6周，重复冠状动脉造影后处死动物。普罗布考组于术前4周给予普罗布考1g, bid ,至实验结束。常规病理制片，观察形态学变化，采用RT-PCR的方法检测c-myc mRNA的表达强度。结果:对照组损伤动脉内膜可见大量平滑肌细胞增生，呈偏心性增厚，普罗布考组内膜增厚程度明显减低。对照组c-myc mRNA相对表达强度(2.73±0.51)明显高于正常动脉(0.82±0.09，P<0.05)，普罗布考组c-myc mRNA相对表达强度(1.44±0.25)较对照组减弱(P<0.05)，但仍高于正常动脉(P<0.05)。结论:普罗布考具有抑制冠状动脉球囊损伤后c-myc表达和内膜增生的作用。
, 百拇医药
[关键词] 普罗布考； 经皮经腔冠状动脉成形术；c-myc基因
[中图分类号] R972.6 [文献标识码] A [文章编号] 1003-3734(2001)-20010119
Effects of probucol on the expression of c-myc mRNA and neointimal hyperplasia after coronary angioplasty in a swine model
YUE xin1, PAN Qi-xing1, LI Ji-fu1, ZHANG Wei1, TIAN Feng-zheng2,LIU Chun-sheng1, MA Dao-xin1, LI Gui-shuang1, CHEN Yu-guo1, YU Ai-qin3, MA Yu-lin3, YANG Kai3
, 百拇医药
(1 Department of Cardiology, the QiLu Hospital of Shandong University, Jinan 250012, China;2 The QiLu pharmaceutical factory,Jinan 250000,China; 3 The Zichuan hospital, Zibo 255000,China)
[Abstract] Objective: To observe the effect of probucol on the expression of c-myc mRNA and neointimal hyperplasia after coronary angioplasty in a swine model. Methods: 19 female New Yorkshire pigs were randomly assigned to receive 2g.d-1 of probucol or control therapy for 4 weeks before percutaneous transluminal coronary angioplasty(PTCA),then PTCA was underwent in all the pigs, Probucol was continued until follow-up angiography 6 weeks after PTCA. Then the animals were killed and taken histopathologic examination. RT-PCR method was used to detect the expression of c-myc mRNA in the injured arteries. Results: The injured artery of the control group had eccentric hyperplastic neointima and the expression of the c-myc mRNA(2.73 0.51) was higher than the normal artery(0.820.09,P<0.05),The injured artery of the probucol group had less hyperplastic neointima and lower expression of the c-myc mRNA(1.440.25)than the control group(P<0.05),but higher than the normal artery(P<0.05).Conclusion: Probucol can decrease the expression of c-myc mRNA and the neointimal hyperplasia after PTCA.
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[Key words] Probucol； Percutaneous transluminal coronary angioplasty； C-myc genes,近年的研究表明抗氧化剂普罗布考(probucol,丙丁酚)具有抑制经皮经腔冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA)后再狭窄的作用[1]，但机制尚不清楚。本实验建立猪冠状动脉球囊损伤模型,观察普罗布考对损伤血管壁内原癌基因c-myc表达的影响，为其防治再狭窄提供依据。
材料与方法
1主要材料与试剂
普罗布考由齐鲁制药厂提供，批号951205；RNA提取试剂盒、PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司生产；RT-PCR试剂均购自美国Promega 公司。
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2动物模型的制备
健康雌性New Yorkshire良种猪19只,体重(64±5)kg，随机分为对照组(n=11)和普罗布考组(n=8)。普罗布考组于术前4周开始给予普罗布考1g， bid，至实验结束。所有动物均于局麻下分离右侧股动脉,在X线透视下将8F JR 大腔引导导管插入左或右冠状动脉开口处,行冠状动脉造影,选用3.5～4mm的球囊置于左冠状动脉前降支中段,回旋支中段或右冠状动脉中远段,于8～10个大气压下扩张30s,放气1min,重复2或3次,球囊与管腔直径比约为1.1：1～1.3：1,重复冠状动脉造影,使管腔保持通畅。以另外一支未损伤的冠状动脉作为正常对照。术后结扎股动脉,缝合伤口。普通饲料喂养6周,重复行冠状动脉造影,静脉注射过量戊巴比妥钠处死动物。迅速取出心脏,分离冠状动脉,根据造影结果切取损伤段血管,选取一部分置10%中性福尔马林中固定,常规染色观察形态学变化；剩余部分封入1.5mL冻存管，置液氮中保存。
3损伤动脉壁内原癌基因c-myc mRNA的检测
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采用RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)方法。
3.1 动脉壁组织RNA的提取 参照试剂盒说明书进行。
3.2 cDNA的合成 取提取的RNA 10μL，冰上依次加入Oligo dT(0.5μg.μL-1) 0.2μL,dNTP(10mmol.L-1) 2.5μL,M-MLV逆转录酶(200u. μL -1)0.5μL,RT 缓冲液(5×) 4μL ,RNA酶抑制剂(40u.μL-1 ) 0.5μL ,加DEPC(1%焦碳酸二乙酯)处理的三蒸水将总体积补至20μL 。37℃水浴30min,95℃放置10min以灭活M-MLV,0℃放置5min。置于-20℃备用。
3.3 PCR产物扩增 C-myc和GAPDH (3-磷酸甘油醛脱氢酶)的引物序列及扩增片段[2]如表1所示。取0.2mL离心管，以逆转录产物5μL 为模板，分别加入上游引物(50mmol?L -1)0.5μL ，下游引物(50mmol?L -1) 0.5μL，dNTP(10mmol?L -1 ) 1μL，Taq DNA聚合酶(5u?μL -1 ) 0.5μL，PCR 缓冲液(10×) 5μL，MgCl2(25mmol?L -1) 5μL，加三蒸水将总体积补至50μL。加入液体石蜡50μL，短暂离心混匀，放入PCR仪，95℃变性5min,然后按下述条件扩增35个循环：94℃45s,55℃45s,72℃45s，最后72℃延伸5 min。
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表1 引物序列及扩增片段
引物 引物序列 扩增片段
c-myc 上游5＇CCAAGCTCGTCTCAGAGAAG 3＇ 下游5＇AATTGTGCTGGTGCGTGGAC 5＇ 398bp
GAPDH 上游5＇CATCACCATCTTCCAGGAGCG 3＇ 下游5＇TGACCTTGCCCACAGCCTTG 3＇443bp
3.4 PCR产物的鉴定及定量分析 取PCR扩增产物10μL，与2μL上样缓冲液(6×)混匀，在2%琼脂糖凝胶中以5V.cm-1的电压电泳2h，紫外透射仪下观察，出现特异性条带为阳性。采用复日FR-980A生物电泳图像分析系统进行琼脂糖凝胶的扫描和扩增条带光密度分析。因为GAPDH在组织中稳定表达[2]，所以以GAPDH作为内参照，并按照下列公式计算c-myc 的相对表达强度：被测基因表达强度=被测基因光密度/GAPDH光密度。
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4 统计学处理 采用EXCEL软件做统计学处理,所有数据以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用t检验，P<0.05表示有显著性差异。
结 果
1 常规形态学观察
实验中动物死亡5只,对照组4只, ,其中1只死于术后血栓形成,2只死于麻醉意外,1只于术中发生室颤致死；普罗布考组1只，死于术中室颤。术后所有存活动物恢复良好。
未损伤段冠状动脉柔软、有弹性,与周围组织无粘连；镜下内弹力板完整, 内膜和中膜无增生,平滑肌细胞排列规则,形态一致,细胞外基质少见。对照组损伤段动脉成灰白色,僵硬,与周围组织粘连；镜下可见内膜成偏心性增厚,主要由平滑肌细胞和胶原构成,此外尚可见泡沫细胞和少量的炎性细胞,内弹力板多处断裂, 中膜局部变薄,平滑肌细胞大量增生,排列紊乱无序。普罗布考组损伤段动脉与周围组织无明显的粘连；镜下内膜增厚程度明显减低。
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2 对c-myc表达的影响
正常组、对照组和普罗布考组损伤动脉壁内c-myc mRNA的相对表达强度分别为(0.82±0.09),(2.73±0.51),(1.44±0.25)。对照组c-myc mRNA的表达明显高于正常动脉(P<0.05)；与对照组相比，普罗布考组c-myc mRNA表达减弱(P<0.05)，但仍高于正常动脉(P<0.05)。表明普罗布考可抑制损伤动脉壁原癌基因c-myc的表达。
讨 论
许多研究发现，血管平滑肌细胞(VSMC)增殖与原癌基因c-myc密切相关。C-myc基因表达增加，其编码蛋白与DNA结合，可促进与细胞增殖有关的基因开放，从而产生细胞增殖效应，提示c-myc基因的激活可能是VSMC增殖的始动因素。本研究发现，球囊损伤后6周，动脉壁c-myc表达强度明显高于正常动脉，进一步证实了c-myc在再狭窄中的重要作用。
, http://www.100md.com
普罗布考广泛应用于降血脂和抗氧化治疗。近来研究表明，它可以抑制平滑肌细胞的增殖和PTCA术后再狭窄的发生。Miyauchid等[3]的研究发现普罗布考可使球囊损伤的兔颈动脉内膜面积减少20%，内膜中VSMC的数目及PCNA(增殖细胞核抗原)阳性细胞显著减少，并降低血小板源生长因子(platelet derived growth factor, PDGF)的表达，表明普罗布考抑制平滑肌细胞的增生及生长因子的表达。Watanabe 等[4]将118例行PTCA术的患者随机分成普罗布考治疗组(P组)和对照组，P组从术前7d开始服用普罗布考0.5g.d-1，术后3个月再次行冠状动脉造影，其残余管腔内径增加，再狭窄发生率下降。MVP (Multivitamins and Probucol Trial)试验和PART试验(the Probucol Angioplasty Restenosis Trial)也得到了相似的结果[1，5]。本实验亦证实普罗布考可抑制冠状动脉球囊损伤后内膜增生，并降低损伤动脉壁内c-myc表达强度，表明普罗布考可在一定程度上抑制c-myc的表达，可能是其防治再狭窄的机制之一。
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[作者简介] 岳欣(1973-)，女，主治医师，主要研究方向为PTCA术后再狭窄的防治。 联系电话：(0531)8602498或(0531)6918375
[参 考 文 献]
[1] Tarif JC, Cote G, Lesperance J, et al. Probucol and multivitamins in the prevention of restenosis after coronary angioplasty[J].N Engl J Med,1997,337(6):365-372.
[2] Bartling B, Hoffmann J, Holtz, J, et al. Quantification of cardioprotective gene expression in porcine short-term hibernating myocardium[J]. J Mol Cell Cardiol, 1999, 31 (1):147-158.
, 百拇医药
[3] Miyauchi K,Aikawa M,Tani T, et al. Effect of probucol on smooth muscle cell proliferation and dedifferentiation after vascular injury in rabbits: possible role of PDGF[J]. Cardiovasc Drugs Ther,1998,12(3):251-260.
[4] Watanabe K, Sekiya M, Ikeda S, et al. Prevention effects of probucol on restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty[J].Am Heart J, 1996, 132(1 Pt 1):23-29.
[5] Yokoi H, Daida H, Kuwabara Y, et al. Effectiveness of antioxidant in preventing restenosis after percutaneous transluminal coronary angioplasty: the probucol angioplasty restenosis trial[J]. J Am Coll Cardiol,1997,30(4):855-862.
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扩增片段
c-myc 上游5＇CCAAGCTCGTCTCAGAGAAG 3＇ 下游5＇AATTGTGCTGGTGCGTGGAC 5＇ 398bp
GAPDH 上游5＇CATCACCATCTTCCAGGAGCG 3＇ 下游5＇ TGACCTTGCCCACAGCCTTG 3＇ 443bp
3.4 PCR产物的鉴定及定量分析 取PCR扩增产物10μL，与2μL上样缓冲液(6×)混匀，在2%琼脂糖凝胶中以5V.cm-1的电压电泳2h，紫外透射仪下观察，出现特异性条带为阳性。采用复日FR-980A生物电泳图像分析系统进行琼脂糖凝胶的扫描和扩增条带光密度分析。因为GAPDH在组织中稳定表达[2]，所以以GAPDH作为内参照，并按照下列公式计算c-myc 的相对表达强度：被测基因表达强度=被测基因光密度/GAPDH光密度。
4 统计学处理 采用EXCEL软件做统计学处理,所有数据以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用t检验，P<0.05表示有显著性差异。
摘自中国新药网, 百拇医药