血液替代品的制备及其抗失血性休克的初步研究
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中国药学会
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王鹤尧 张金平 屈隹秋
首都医科大学附属北京红十字朝阳区院药剂科 100020
摘 要 目的：制备以聚合牛血红蛋白(polyHb)为基质的血液替代品并评价其对失血性休克的复苏效能。[方法]用乙醇酸聚合牛Hb，超滤去除大于1000KD的大分子和小于100KD的小分子，得血液替代品基质poLyHb，用生理溶液平衡后，检测其生物学活性；从股动脉放血诱导大鼠休克，维持平均动脉压35mmHg 30min后，按大鼠的失血量输人等量的复苏液。复苏液为全血、乳酸化林格氏溶液及三种用聚合牛血红蛋白(polyHb)制备的血液替代品(6%polyHb溶液、12%polyHb溶液和12%polyHb+GSH溶液)。观察休克大鼠的复苏效果。将数只大鼠于输液后5min活杀，检测缺血再灌的心肌中自由基强度。[结果]牛Hb被聚合并超滤后，polyHb中超过64KD至500KD的组分占88%；polyHb的氧亲和力、血氧饱和度和溶液的溶氧量与全血相近，其溶液粘度低，近似于牛顿液体；从血血、心率和心电图综合来看，12%polyHb+GSH溶液和全血的复苏效果最好，二者无显著差异。12%polyHb+GSH溶液在心肌缺血再灌中产生基比全血稍低，但二者差别不显著。12%polyHb溶液产生的自由基最多。[结论]牛Hb经乙醇醛聚合后，分子量分布、生物学活性和流休力学特性比较理想，12%polyHb+GSH溶液可有效复苏失血性休克的大鼠并可有效减少缺血再灌时自由基产生，其效能炎似或稍好于全血。
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关键词：血液替代品 牛血红蛋白 乙醇醛 失血性休克 缺血再灌
将血红蛋白(Hb)聚合是血液替代品研究的重要途径之一。长期以来，人们一直在寻找合适的聚合剂，以便能稳定Hb(α2β2，64KD)四聚体并产生α2β2的寡聚休(< 500KD＝。稳定四聚体结构可阻止 Hp裂解为αβ二聚体从而防止肾损伤。α2β2的血浆半寿期只有 2～4h，形成寡聚体则可将半寿期延长并可降低胶体渗透压和粘度。目前已有数种聚合的Hb产品在美国进入了Ⅲ临床试验。
1983年，Acharya报道用乙醇醛成功聚合了RNase，随后又有报道用乙醇醛可聚合羟甲基Hb和天然人Hb。乙醇醛聚合的人Hb性质稳定，但未见有关的迸一步研究报道。
本实验首次用乙醇醛聚合牛Hb，研究了反应产物聚合牛血红蛋白(polymerized bovine Hb，polyHb)的生物学活性和流体力学特征，建立了主要以血压为指标的失血性休克的大鼠模型，比较了全血、乳酸化林格氏(LR)溶液以及用聚合牛血红蛋白(polyHb)制备的血液替代品(6%polyHb溶液、12%polyHb溶液和12%polyHb+GSH溶液)的复苏效果。
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材料和方法
材料：
试剂：乙醇醛(Sigma)，NaBh4(Acros)，Sephacryl S-300(Phamacia)，凝胶过滤高分子量子量子量校准试剂盒(Phamacia)，蛋白质低分子量极准(Sigma)，戊巴比妥钠(北京芳草医药化工)，谷胱甘肽(GSH)(Sigma)，其余皆为分析纯。
仪器： 2XZ型旋片真空泵(浙江临海精工真空设备厂)，235/200高压液相色谱仪(PERKIN ELMER)， SK-GEL G4，OOOSW凝胶过滤柱 (TOYO SODA)，垂直板电泳仪 (北京六一仪器厂)，血液透析器5A(1000KD)(Evaflux)，100KD聚砜膜堆(Millipore)，ABL520血气分析仪(Radiometer)，KJB3粘度仪(北京科海公司道生理记录仪)( NHON DOHDEN)，ESP300电子自旋共振仪(BRUKER)，输液泵(上海沪西分析仪器厂)等。
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原料：无基质牛Hb，用板框过滤法制备。
生理透析液：110mM NaCl， 3.5mM KCl，1mM MgCl2，27mM NaHCO3，O.5mM Na2HPO4，0.5mM KH2PO4，2.1mM CaCl2， pH7.4。
动物：标准Wistar大鼠，雄性，体重300～450g，标淮鼠食和饮水(军科院实验动物中心)。
复苏液：1 大鼠全血；2 LR溶液：乳酸化 Linger's溶液(102mM NaCl，4mM KCl，1.5mM CaCl2，28mM乳酸纳)；3 12% polyHb溶液：12%polyHb溶于生理透析液而成；4 6%polyHb溶液：6%polyHb溶于生理透析液而成；5 12%polyHb+GSH溶液：12% polyHb溶液中加入4mM GSH。
方法：
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一、血液替代品的制备：
1 用乙醇醛聚合牛Hb。
2 牛Hb聚合程度的检测：
(1)不连续密度梯度SDS-PAGE。
(2)HPLC检测：取少量聚合产物，用洗脱液稀释成1mg/ml，于PERKIN EL MER 235/200 Hplc仪(色谱柱为TSK-GEL G4，OOOSW)上检测聚合产物的分子量分布。用凝胶过滤高分子量校准试剂盒进行标定并绘制校淮曲线。
色谱条件：色谱柱：TSK-GEL G4，000SW；柱温： 20℃；洗脱液：1/15MpH7.4 磷酸盐冲液，含0.1M NaCl；流速：O.5ml/min；紫外检测波长；280nm；进样体积：10ml。
, http://www.100md.com 3 用5A血液透析器将聚合产物中大于1000kD的成分除去，用100KD膜堆去除聚合产物中小于100kD的成分，同时用生理透析液进行平衡。
4 氧亲和力和Hb合量分析：用ABL520血气分析仪检测。
5 透析结束后的polyHb溶液的粘度测定：取透析后的12%polyHb溶液，用KJB3粘度仪检测其在不同切变率时的粘度值。
二、抗失血性休克试验：
1 大鼠用戊巴比妥钠(35mg/Kg体重)麻醉(肌注)并肝素化(1,000u/Kg)(肌注)。
2 将注满100u肝素/ml生理盐水的导管插人一侧颈外静脉以备输液。与多道生理记录仪的传感器相连的导管插入一侧劲动脉以记录血压和心率。另一导管插人一侧股动脉放血诱导休克。将电级插人四肢皮下记录心电图。
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3 30min后大鼠苏醒，测其血压、心率及心电图。以5.6ml/Kg体重计算大鼠血量。从股动脉以O.5ml/min的速度放血以诱导休克，维持平均动脉压35mmHg30min。
4 大鼠被随机分为六组，每组6只：
(1)组：不复苏组，观察休克的死亡时间及死亡率。
(2)组：全血组，将从股动脉放出的大鼠血液以1ml/min的速度从静脉回输。
(3)组：LR溶液，将LR溶液按大鼠失血量以1ml/min的速度从颈静脉回输。
(4)组：6%polyHb组，将6%polyHb溶液按大鼠失血量以1ml/min的速度从颈静脉回输。
(5)组：12%polyHb组，将12%polyHb溶液按大鼠失血量以1ml/min的速度八颈静脉回输。
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(6)组：12%PolyHb+GSH组，特12%polyHb+GSH溶液按大鼠失血量以1ml/min的速度从颈静脉回输。
5 分别观察各组休克末、输液后5min、30min、60min的心率、血氐和心电图。
6 取数只大鼠重复各组实验，于输液后5min活杀，迅速取其心肌存于新鲜的液氮中，以备检测自由基强度。
7 自由基检测：将心肌置指形杜瓦中，用新鲜液氮浸泡，于电子自旋共振仪中扫描。伙器参数为：调制频率100kHz，调制幅度5.27G，接收机增益5.0，时间常数163.84ms，扫描时间83.89S，中心磁场H03400G微波频率9.42KMHz，叠加三次扫描.扫描范围为311O～361OGorss，积分取值范围3305～3390Gorss。
8 统计处理：采用PC/statistical analysis system 6.04版、按具有一个重复测量的2因素设计进行统计分析。
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结 果
一、血液替代品的制备：
1 电脉显示，牛Hb被有效聚合，聚合产物经SDS变性后的分子量以 n×16KD( n≥1)的形式依次递增，而天然牛Hb经SDS变性后分解为α及β亚基，即仅为16KD。由于在血浆及PBS等非变性条件下天然牛Hb的基本结构为αβ二聚体，故聚合产物为(αβ) n(n≥1)的混合物。
图1 电脉检测hb聚合程度
1，2，6，7：polyHB，在16KD处为未交联的亚基，32KD处出现两条带，提示在α亚基之间和在β亚基之间出现交联，前一条带应为α-α，后一条带为β-β。3，4：天然HB，α及β链被明显区分。5：蛋白质分子量标准14KD，20KD，30KD，43KD，67KD，94KD。
, http://www.100md.com 2 高分子量蛋白质标准的HPLC洗脱曲线如图2所示，以蛋白质分子量的对数值为纵坐
图3 蛋白质分子量标准曲线
标，以Ve/Vo为横坐标，绘制蛋白质分子量标准曲线(图3)。1.为甲状腺平均水平蛋白(thyroglobuling,669KD)、铁蛋白(ferritin,440KD)、触梅(catalase,232KD)和醛缩酶(aldoase,158KD)的混合物；2.为蓝葡聚糖(blue dextran,2000KD)；3.为人白蛋白(human albumin,66KD)。
图3 蛋白质分子量标准曲线
3 如图4所示，牛Hb被有效聚合，聚合产物中(αβ)4和(αβ)6最多，但也有超过1，000KD的大分子存在。经积分处理，超过500KD的高聚物占总体的24%，解离的32KD的αβ二聚体占4.4%,64KD至500KD的组分占71.63%。
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4 经过1000KD的血液透析器和100KD的腊堆超滤后，超过500KD的组分还占4.6%，32KD的占7.3%，64KD至500KD的组分占88%(图5)
图4 聚合瓜结束时的洗脱曲线
可见较多的超过1000KD的高聚Hb和未反应的αβ二聚体。
图5 超滤后polyHb的洗脱曲线
可见仍有32KD的αβ二聚体及少量大于1000KD的高聚Hb。
5 聚合产物透析后经血气分析仪检测，结果见表1：
表1 天然Hb溶液和polyHb溶液的生物学活性比较
pH
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P50
mmHg
tHb
g/dl
O2HB
%
COHb
%
metHb
%
RHB
%
TO2c
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Vol%
sO2
%
SFHb
7.11
30.60
14.9
94.7
2.0
3.3
0
21.0
100
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polyHb
7.17
30.31
14.2
87.4
3.5
7.1
2.1
18.0
97.7
注：SRHb为不含RBC基质的天然Hb溶液。
polyHb的佣保持与SFHb一致的摒亲和略，在聚合和透析的过程中，mitHb和COHb稍有升高，并出现了2.1%的异常Hb，从而使O2Hb的量下降到87.4%，但仍然保持了很高的血氧饱和度和溶氧量。
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6 经粘度测量，polyHb溶液近似于牛顿液体，而正常的人血液为非牛顿液体，见表：
表2 正常人血液和 polyHb深液粘度比较 切变率s-1
5
80
160
人血(男性)(mPa.s)
10.81-13.27
5.53-6.53
4.25-4.97
人血(女性)(mPa.s)
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9.21-12.16
4.93-5.83
3.87-4.53
polyHb(mPa.s)
4.32
4.03
3.98
二、抗失血性休克试验：
1 不复苏组在各复苏组开始输液时不进行复苏处理，20-30min后全部死亡。
2 各组于正常、休克末和复苏后各时间点的血压变化情况见表3：
表3 各组血压变化情况 组别
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正常
休克末
5min
30min
60min
Blood
101.8±2.8
39.8±1.6
98.8±4.9
96.2±8.2
86.5±4.5
LR solution
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112.0±7.5
38.6±1.7
75.2±20.0
60.3±9.3
54.5±7.7
6% polyHb
104.8±3.4
38.9±2.6
92.8±5.4
86.5±5.7
75.6±3.5
12% polyHb
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103.3±5.6
37.2±1.2
97.9±5.3
93.8±6.69
90.9±8.2
12% Hb+GSH
100.0±2.9
38.6±1.8
90.0±4.8
93.45±2.1
94.7±3.4
注：Blood为全血缓，LRsolution为LR溶液缓，余下类推。各缓值都为均值±标准关节，单位为mmHg。
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图6 各复苏组血压的比较
2.1 统计处理：经方差分析，各组间正常时对休克末血压差别不显著。输液后60min，全血组明显优于LR组和6%polyHb组，但于12%polyHb组和12% polyHb+GSH组差别不显著。
3 各组于正常、休克末和复苏后各时间点的心律变化情况见表4，图7：
表4 各组心律变化情况 组别
正常
休克末
5min
30min
60min
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Blood
432±46.2
324±59.7
347±51.9
383±54.2
399±62.1
LR solution
420±10.3
302±27.3
346±73.1
323±47.8
310±45.8
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6% polyHb
402±36.9
323±45.9
317±38.0
350±42.8
367±38.3
12% polyHb
411±20.7
312±23.8
297±30.6
320±34.6
335±39.4
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12%pHb+GSH
417±37.9
328±16.0
354±16.8
370±24.1
38522.4
注：各组值都为均值±标准差，单位为：次/min
图7 各复苏组心律比较
3.1 统计处理：经方差分析，各组间正常时、休克末和输液后60min各组间差别也不显著。
4 各组平均体重、平均绝对失血量(ml)和相对失血量(%)见表5：
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表5 动物失血量
不处理
Blood
LR
olution
6%polyHb
12%polyHb
12%oHb+GSH
体重g
328±30.0
275±13.8
281±12.8
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282±23.8
292±29.9
310±36.3
失血量ml
7.0±1.6
6.5±1.3
6.6±2.2
6.8±0.9
7.7±1.6
7.8±1.4
失血量%
38.1±6.9
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42.1±8.8
41.9±14.9
42.8±4.6
44.9±9
44.9±4.0
注：“失血量%”指所失血量占总血量的百分数。
5 心电图：正常大鼠心电图加压肢导联的波形与人不同。虽然在50mm/s纸速时可明显区别出其波形为P-QRSR’-T，但在25mm/s纸速时，RSR’S’难以区别，故本实验将其视为RS波。正常大鼠QRS波群以R波为主，S波位置较Q波为高，T波位置相应升高。对于各实验组而言，休克末期时ST段升高，T波高耸超过R波，这是心肌缺血缺氧损伤的曲型改变。在LR组，与休克末期相比，输液后心脏灌流有所改善，T波开始降低，心律有所增加，但随后T波再次上升，心律减慢，说明机体持续缺氧，心肌进行性地受到损伤。对于6%PolyHb组，输液后心肌供氧迅速恢复，R波显著上升，但在输液后60min，可见室性早搏，显示心脏已发生器质性改变。12%PolyHb组输液后30min即可见明显室性早搏，提示心肌受损比6%PolyHb组严重。在全血组和12%PolyHb+GSH组，未见心电图有明显异常。(图8)
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LR 溶液组 6%PolyHb组
12%polyHb组 12%polyHb+GSH组
全血组
图8 各组心电图的比较
各组的心电图时间从上至下分别为：正常、休克末、再灌5、30和60min。
6 取各组于再灌后5min的心肌标本检测自由基的产生情况，所测得的活性氧信号积分值用标本重量加以修正，结果见表6，图9：
表6 各组心肌标本活性氧信号积分值
Blood
12%polyHb
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12%oHb+GSH
nomal
例数
4
4
4
5
平均重量mg
405.8
375.4
395.1
351.4
平均积分值
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23092737
24445546
22176749
15968263
平均修正积分值
57105±8128
65079±9617
56473±4869
46395±9600
注：1 积分取值范围在3305-3390Gorss之间；
2 修正方式为积分值队长以标本重量。
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图9 各组心肌中自由基产生情况比较
失去平衡所致。在缺血再灌注时，机体中天然存在的内源性抗氧化物质明显减少，大量的自由基 引起了一系列复杂的分子及亚细胞水平的病理过程。polyHb溶液中缺少自由基歧化系统，而其 携氧能力与血液相近，完全可以想象它输入体内所必然引起的严重的缺血再灌注损伤。
GSH是一个含巯基的三肽，对维持细胞的氧化还原状态起着重要作用。其作用用方式主要 有三神：1.它是谷胱甘肽过氧化物酶的底物，按酶可避免高毒性的羟自由基和脂质过氧化物的 出现。2.GSH也是巯基转移酶的底物，后者能持续蛋白质巯基处于还原状态。3.GSH本身含巯 基结构，能够直接清除氧自由基。 4.GSH可有效防护自由基对细胞膜蛋白和细胞器的颈基的氧 化，从而维持它们的正常功能。因此我们将GSH加人polyHb溶液中，以期能维持机体蛋白疏基 的稳定、减轻缺血再灌注损伤，增强复苏效果。
, http://www.100md.com 从实验结果可看出，虽然全血组在输液后5min升压效果最明显，但此后却呈逐渐下降趋势； 而12%polyHb+GSH组虽然在输液后5min升压效果不加全血，但却逐渐上升，在60min时与全 血组无差别。12%polyHb组的升压效果也比较好，与全血类似；LR溶液组的升压效果最差，其 次是5%polyHb组。血压仅反映了心输出量与血管张力的关系，而心律则更能反映心脏的状态。 但本实验中，在休克末和输液后1h，各组间心律变化差别都不显著。但从心律变化的趋势来看， 12%polyHb+GSH与全血类似；LR组的心律在灌注后上升，但随后却逐渐下降，这说明在恢复 血容量的同时，向机体补充足够的氧也是很重要的，否则恢复血容量所带来的益处将被持续的缺 氧所抵消。12%polyHb组和6%polyHb组在灌注后心律反而下降。前者下降更多，这可通过自 由基的产生得以解释，因为前者比后者产生的自由基更多，从而使心肌受到更大的损害，但同时 由于供氧的恢复，心肌的代谢异常也逐渐得以纠正，心律逐渐升高。可直接反映心肌受损状况的 心电图的结果也况明了同样的同题。加人GSH的优势从血压、心律和心电图上得到明显的体现， 在检测缺血再灌的心肌中的自由基时，这一优势得到了直接的说明。虽然各再灌组都产生了自由 基，但12%polyHb+GSH组的自由基产生量明显低于全面组和12%polyHb组，其中以12% polyHb组的自由基量最高。polyHb组的动物都出现了Hb尿的原因是在制备血液替代品时，未能完全去除未反应的天然牛Hb所致。这一副作用并不是Hb类血液替代品所固有的.它可通过 改进生产设备而被克服。
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在建立休克模型时，休克标准的统一并不是很容易的事。虽然各实验组的平均失血量都在 40%左右，但对每个个体而言差异比较大。在实验中我们发现，有的大鼠在失血仅为30%时 就循坏衰竭而死，有的却能耐受高达60-70%的失血，因此难以用失血量作为统一的标准。在 以血店为标准时，由于机体对血容量的减少有一系列的代偿途径，血压的变化与失血量并不总是 一致的，尤其在维持休克状态时，血压的波动比较大。
需要加以说明的是，在临床上对失血性休克的救治中，对复苏液的使用遵循的是足量原则， 往往远远超过损失的血量。而在本实验中，我们仅仅使用了与失血量等量的复苏液，这可能不足 以完全复苏休克的动物，但却可以在等量的情况下比较不同的复苏的复苏效果。
本文摘自2000北京地区药学学术年会《大会论文集》, 百拇医药
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