咪唑斯汀在实验性大肠炎中对内脏感觉传入神经敏感性和炎症反应的影响
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局部炎症是一系列疾病[包括哮喘、银屑病、类风湿性关节炎和炎性肠病(IBD)]的基础病变。 以 IBD为例，它是一种伴有上皮损伤、腹痛、平滑肌功能和上皮运转状况改变的复发性疾病。这一系列的事件引发不能控制的炎症,后者集中表现为由细胞因子诱发的免疫系统的激活和增殖,最终导致某些炎性介质,主要是与5-脂氧合酶(5-LO)途径有关的介质的合成增加。因此一些免疫细胞(包括中性粒细胞)集结于炎症部位,肥大细胞数和组胺释放在 IBD时也增加。
Rao 等报道 IBD患者在病情活动时,其所能忍受的直肠内灌注的最大盐水量减少,这可以用患者对疼痛刺激的敏感性增加解释。近来有研究证明,用三硝基苯磺酸(TNBS)诱发大肠炎时,腹肌的尖峰脉冲频率增加。在炎症情况下,肥大细胞集结到快动能神经纤维周围说明它们可能与内脏神经的超敏反应有关。
因此,组胺的释放可能在炎症时的功能改变和上皮损伤中起一定作用。本研究的目的是通过动物实验确定一种强效 H1受体拮抗剂咪唑斯汀在抗过敏反应的同时,是否具有抗炎潜能,同时与另一种H1受体拮抗剂特非那定进行对照。
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材料和方法
1.动物和材料
选择雄性Wistar鼠，体重280～300 g。在异氟醚麻醉下通过一个导管在离直肠7 cm 处用三硝基苯磺酸(TNBS 40 mg/kg，乙醇50%)进行大肠灌注以诱发大肠炎。大肠炎发展很快,在第3天时,生化改变、肠水肿、溃疡、上皮坏死和粘连已很明显。组织学显示有急性和慢性免疫细胞出现。上述改变与在IBD 时所观察到的特征一样。对照组动物应用盐水进行同样处理。共进行5 组动物试验:3组大肠炎动物事先用咪唑斯汀(0.03 mg/kg、0.3 mg/kg、3 mg/kg),1组大肠炎动物用咪唑斯汀赋形剂(1%Tween),1组健康动物事先用咪唑斯汀3 mg/kg 处理。在另一试验中, 应用另5 组动物:3组大肠炎动物事先用特非那定(3 mg/kg、10 mg/kg、30 mg/kg),1组大肠炎动物用特非那定赋形剂(1%Tween),1组健康动物事先用特非那定30 mg/kg 处理。咪唑斯汀、特非那定或赋形剂在诱导大肠炎前1h 不麻醉下随机管饲,并在1、2、3天重复进行。对大肠直肠的扩张刺激在最后一次管饲后1h 进行,此后将动物处死。
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2.大肠直肠扩张敏感性检测
将一气球附着于一导管, 在异氟醚麻醉下插入肛门括约肌深入2 cm, 待动物完全清醒后, 吹胀气球使压力达到30 mmHg,此时气球直径增大11～13 mm,维持此压力。这种亚阈值压力在正常大鼠可引起轻度腹肌收缩，因此引起的疼痛反应以10 min内动物身体扭动的次数进行定量。
3.大肠炎严重程度的检测
处死动物后, 将最远端的10 cm大肠取下。按表1的标准确定大体损伤指数。组织湿重作为水肿程度的指标。然后将组织纵形切成两块。一块用液氮冰冻,以供测量髓过氧化酶(MPO)活性;另一块保存于10%甲醛液中供组织学检查。
表1 大肠损伤肉眼记分标准
表现
, 百拇医药 得分
正常外表
局部充血,无溃疡
溃疡,无炎症
溃疡,有一处炎症
两处或更多处溃疡, 伴有炎症
主要部位损伤纵向延伸超过1cm
损伤延伸>2 cm 时,每1cm加1分
轻度粘连
重度粘连
0
1
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2
3
4
5
6～10
加 1
加 2
MPO活性以MPO单位表示(IU/mg蛋白)。甲醛固定的标本用苏木精伊红染色,按表2的标准估计组织学损伤。
表 2 大肠炎组织学记分标准
表现
得分
上皮完整,无白细胞或出血
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上皮损伤 < 25%,局灶性白细胞浸润上皮损伤25%,局灶性白细胞浸润和出血和出血
上皮损伤≥50%,大范围白细胞浸润和出血
上皮损伤 > 50%,广泛白细胞浸润和出血
0
1
2
3
4
4. 统计学处理
所有数据以均数±标准差表示。各组均与赋形剂处理的加TNBS组进行统计学比较,用Duncan's试验法,P < 0.05 认为有显著性差异。
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结 果
1.TNBS的效用
TNBS诱发的肠炎伴有内脏超敏感性加强, 引起对大肠远端气球扩张所致腹部扭身反应的明显增多(图1)。此外,TNBS导致特征性的肉眼损伤(图2),包括溃疡、坏死和与其他器官的粘连、组织重量增加(图3)和 MPO活性的增加(图4)。肉眼损伤可从组织学损伤指数增加得到反映(图5)。
2.咪唑斯汀对TNBS 所致损伤的保护作用
在对照动物中,咪唑斯汀(3 mg/kg，口服)对气球扩张的扭身反应(图1)、上皮完整性(图 2)、大肠重量(图 3)、MPO活性(图 4)或组织学记分(图5)都没有明显作用。然而,在大肠炎时, 咪唑斯汀明显地使气球扩张所致的内脏超敏感性下降。在剂量达到 0.3 mg/kg 时, 最多可下降49%，肌痉挛的数目自28.83±1.51降至19.83±1.74(图1)；当剂量为3.0 mg/kg 时,痉挛数明显减少34%；而当剂量为0.03 mg/kg 时, 则无明显效果(3%)(图1)。咪唑斯汀3.0mg/kg 时,大肠损伤部分得到逆转(自4.5±0.18降至1.00±0.54,78%),组织学记分(自1.73±0.32 降至0.8±0.31,54%)、 组织重量(自1.48±0.16g降至0.88±0.10g,69%) 和MPO活性(自1.12±0.23 降至0.43±0.10 IU/mg蛋白,66%)都下降(图1～5)。同时应用咪唑斯汀(3 mg/kg)和TNBS 后的组织学表现比单用TNBS 时的组织损伤减轻。在应用小剂量咪唑斯汀时,无论是上述参数,还是大肠损伤、总的组织学记分、组织重量增加或MPO活性都没有明显的改善(图1～5)。
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特非那定剂量为3 mg/kg、10 mg/kg或30 mg/kg时对TNBS诱发的改变如气球扩张的反应、上皮的完整性、大肠重量、MPO活性等方面都没有明显的影响。
图 1 咪唑斯汀对TNBS(40 mg/kg)诱发的大肠炎直肠内气球扩张的影响(n均=6)。
*：与TNBS/赋形剂组比较，P < 0.05
图 2 咪唑斯汀对TNBS(40 mg/kg)诱发的大肠大体损伤的影响(n均=7～8)。
*：与TNBS/赋形剂组比较，P < 0.05
图 3 咪唑斯汀对TNBS(40 mg/kg)诱发的大肠重量增加的影响(n均=7～8)。
*：与TNBS/赋形剂组比较，P < 0.05
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图 4 咪唑斯汀对TNBS(40 mg/kg诱发的MPO活性变化的影 响(n均=7～8)。
*：与TNBS/赋形剂组比较， P < 0.05
图 5 咪唑斯汀对TNBS(40 mg/kg)诱发的组织学损伤的影响(n均=7～8)。
*：与TNBS/赋形剂组比较， P < 0.05
讨 论
本研究证实了咪唑斯汀在大鼠大肠炎模型中的抗炎和抗疼痛的效用。咪唑斯汀的效用首先是可以减轻 TNBS 诱发的痛觉超敏性反应。咪唑斯汀在本试验中显示的抗疼痛效用可能是通过逆转炎症过程中免疫细胞的刺激而发生的。由于本试验中咪唑斯汀的抗疼痛效用所需的剂量与抗组胺反应所需剂量相似,因此可以考虑大肠炎时对气球扩张的超敏感性的下降可能与肥大细胞稳定所致的组胺释放减少和/或对组胺受体的拮抗有关。但不支持这一观点的理由是特非那定抑制黏膜肥大细胞介质释放100%所需的高3倍的剂量和比ED50值高4倍的剂量对TNBS诱发的大肠炎所致的疼痛反应并无任何作用。
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咪唑斯汀的第二个效用是减少TNBS诱发的损伤和炎症。咪唑斯汀在3 mg/kg时可抑制TNB诱发的组织损伤、组织重量增加和MPO活性改变。本研究中咪唑斯汀的抗炎效用不大可能是由于对H1受体的拮抗或肥大细胞的稳定作用,因为大剂量的特非那定对 TNBS诱导的损害、组织重量的增加或MPO活性改变并无保护作用。
在本研究中,咪唑斯汀抗疼痛的作用似乎高于它对TNBS 诱发的损伤、组织重量增加和 MPO活性改变的影响。这可能与试验的设计有关,因为咪唑斯汀的最后治疗是在气球扩张前 1h,这个时限有利于咪唑斯汀发挥其作用以改变疼痛反应,但对TNBS 的远期效应如组织损伤和炎症影响较小。
咪唑斯汀抗炎和抗疼痛的机制仍有待阐明。本研究中咪唑斯汀的抗炎作用既不是通过对组胺受体的阻断实现的,也与肥大细胞组胺释放的减少无关。
我们曾报道了花生四烯酸诱导的大鼠爪水肿也能为咪唑斯汀所缓解,其机制与抗组胺效应无关, 而可能与对5-脂氧合酶( 5-LO)的抑制有关。5-LO抑制剂具有抗疼痛作用，因此,本研究所观察到的咪唑斯汀的抗疼痛作用可能与它抑制5-LO的性质有关。
总之,本研究证明咪唑斯汀能缓解炎性疼痛,减少中性白细胞浸润,它可能在治疗与肠炎有关的超敏感性疼痛和炎性损伤中发挥作用。
(顾瑞金译自 Arzneim-Forsch./Drug Res.1998,48), 百拇医药(JonGoldhill等)