反相Hplc法测定全血中环孢素A的血药浓度
黄健，戴志凌，张明雄，邱丽珍，崔岚 昆明医学院第二附属医院药剂科，昆明市 650101
中图分类号:R969 文献标志码:B 文章编号:1001-0408(2000)05-0220-02
摘要：目的：建立一种用反相HPLC法测定全血中环孢素A的血药浓度的分析方法。方法：反相HPLC，YWG-C18柱，流动相为乙腈-甲醇-异丙醇-水(57∶24∶1∶18)，流速：1.0ml/min，柱温：71℃，检测波长212nm。结果：环孢素A浓度在40.2μg/L～ 1286.4μg/L范围内有良好的线性关系，相关系数r=0.997。平均回收率为98.04%，RSD为0.6%，n=9。日内差RSD≤5.4%(n=5)，日间差RSD≤6.2%(n=5)。结论：此法简便、稳定，可应用于移植病人的CsA血药浓度监测。
关键词：反相HPLC法；环孢素A；血药浓度监测
, 百拇医药
ABSTRACT：OBJECTIVE： To develop a method to determine the contents of cyclosporine A in human whole blood. METHO_ DS： Detection was performed on YWG- C18 column with acetonitrile- methanol- isopropand- water( 57∶ 24∶ 1∶ 18) ， as mobile phase. Detecting wavelength was 212nm； The flow rate was 1. 01ml/min and column temperature was 71℃ . RESULTS： The calibration curve was linear in the concentrations ranged from 40. 2μ g/L to 1 286. 4μ g/L( r=0. 997) . The average recovery was 98. 04% with RSD of 0. 6% ( n=9) . The RSD within day was less than 5. 4% ( n=5) and the RSD between days was less than 6. 2% ( n=5) . CONCLUSION： This method is simple and reliable and can be applied to the monitoring of blood drug concentration in patients receiving transplantation.
, 百拇医药
KEY WORDS： RP- HPLC； cyclosporine A； monitoring of drug concentration in blood
环孢素A(CyclosporinA，CsA)是由真菌TolypocladiumInflatumGams分离获得一种天然的亲脂性环十一肽，具有选择性的免疫抑制作用，可有效地抑制器官移植术后的排斥反应[1]。其血药浓度与疗效和毒副作用密切相关。由于CsA的治疗窗口窄，体内过程存在较大的个体差异。因此，需要在治疗过程中进行血药浓度监测。
目前，国内外测定全血中CsA的方法主要有放射免疫法(RIA)、荧光偏振免疫法(FPIA)和高效液相色谱法(HPLC)，因测定原理和专一性不同，各方法下CsA的有效血药浓度各异。HPLC法能特异性测定CsA的全血浓度，能客观地反应CsA在血中的浓度。由于内标物环孢素D难以获得且价格昂贵，所以我们用外标法来监测肝移植患者术后早期全血中CsA的情况。
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1 材料和方法
1.1仪器与试剂：(1)仪器：美国VarianProstar高效液相色谱仪、VarianProstar230泵、VarianProstar310UV检测器；奥特宝恩斯仪器有限公司制造TC-100柱温箱、VarianStarBar工作站。(2)试剂：CsA标准品(华西医科大学器官移植室提供)，甲醇、乙腈、异丙醇均为色谱纯，水为过滤重蒸水，正己烷为分析纯，乙醚重蒸后使用。
1.2色谱条件：YWG-C18(150mm×4.6mm，4.5μm)，流动相：乙腈-甲醇-异丙醇-水(57∶24∶1∶18)，流速：1.0ml/min，柱温：71℃，UV检测波长：212nm，进样量：20μl。
1.3标准溶液制备：精确称量CsA80.4mg，用甲醇溶解，稀释配制成8.04mg/LCsA甲醇标准溶液，贮藏于冰箱备用。
, http://www.100md.com 1.4血样采集及样品处理：取CsA标准溶液于50℃水浴挥干，加入1ml抗凝血样混匀，加入50mmol/LNaOH液2ml碱化，乙醚6ml提取，在旋涡混合器上振摇5min，离心5min(2500～3000r/min)，取乙醚层挥干。加入1ml甲醇和0.5ml50mmol/L的HCl液，振摇混匀，加入正己烷3ml提取，取下层液。再用50mmol/LNaOH1ml和乙醚3ml提取，取上层液，于50℃水浴空气吹干。残渣溶于80μl流动相，20μl进样。
2 实验结果
2.1色谱行为：见图1～图3。
2.2线性范围及检测限：在具塞离心管中加入不同浓度的CsA标准溶液，50℃水浴挥干后分别加入空白全血1ml，制成CsA浓度分别为40.2、80.4、160.8、321.6、643.2、1286.4μg/L的全血标准液(n=6)，按样品处理项下操作测定，以CsA浓度对色谱峰面积回归，结果表明：在40.2μg/L～1286.4μg/L范围内线性良好，回归方程为：y=225.91X+822.51，r=0.997，n=6。本方法最低检出全血中CsA浓度为40.2μg/L。
, 百拇医药
2.3回收率试验：分别取CsA标准液适量及全血1ml，制成浓度为80.4、321.6、1286.4μg/L的CsA全血样品，按样品处理方法抽提后进样，依照此法测定，结果见表1，总平均回收率为98.04%，RSD为0.6%，n=9。x表1CsA回收率测定(±s，n=3)
2.4进样精密度实验：取CsA标准溶液，重复进样5次，根据峰面积值，计算得平均峰面积：A=139366，RSD=3.32%。
2.5稳定性实验：对高、中、低3种浓度的全血标本，分别于1天内(n=5)和1个月(n=5)分散测定，求算日内误差及日间误差，结果见表2。x表2CsA稳定性实验(±s，n=5)
3 讨论
3.1文献报道[2]CsA的代谢物达20多种，HPLC法测定CsA为原形药物浓度，其结果不受代谢物影响，而FPIA法测定则为原形药和代谢物总量，FPIA法测得的血药浓度高于HPLC法1.5倍以上[3]。由于CsA的代谢物毒性目前还不清楚，而且代谢方式根据不同患者(不同疾病、不同治疗)而有差异，因此，HPLC法测定值与药理效应之间具有更好的量效关系[3]。本组建立的HPLC法准确性高，变异小，专一性强，且成本较FPIA法低。
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3.2目前，大多数医疗单位都拥有高效液相色谱仪，而FPIA法所需的TDX仪仅少数医院拥有，且试剂盒价格昂贵，有效期短，检测样品少，极易造成浪费，所以HPLC法特别适合样品少且需开展CsA血药浓度测定的单位。
3.3色谱柱温度是CsA测定中的重要参数，我们曾做过实验，色谱柱在低于70℃时都得不到尖锐对称的CsA峰。采用重蒸乙醚作抽提液，我们观察到最后重组的样品对柱污染小，且对色谱中的峰形有利。加入NaOH液是为了破坏RBC，增加CsA的萃取率。利用CsA在酸性环境下不溶于正己烷这一特性，用正己烷能明显除去全血样品中的杂质干扰物，使色谱图更加清晰。
3.4HPLC法监测CsA治疗的有效全血浓度为100～300μg/L[2]，我们用此法监测了本院开展的3例肝移植病人的血药浓度，其谷浓度均在范围内，很好地控制了病人的排斥反应。摘自：中国药房, http://www.100md.com
中图分类号:R969 文献标志码:B 文章编号:1001-0408(2000)05-0220-02
摘要：目的：建立一种用反相HPLC法测定全血中环孢素A的血药浓度的分析方法。方法：反相HPLC，YWG-C18柱，流动相为乙腈-甲醇-异丙醇-水(57∶24∶1∶18)，流速：1.0ml/min，柱温：71℃，检测波长212nm。结果：环孢素A浓度在40.2μg/L～ 1286.4μg/L范围内有良好的线性关系，相关系数r=0.997。平均回收率为98.04%，RSD为0.6%，n=9。日内差RSD≤5.4%(n=5)，日间差RSD≤6.2%(n=5)。结论：此法简便、稳定，可应用于移植病人的CsA血药浓度监测。
关键词：反相HPLC法；环孢素A；血药浓度监测
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ABSTRACT：OBJECTIVE： To develop a method to determine the contents of cyclosporine A in human whole blood. METHO_ DS： Detection was performed on YWG- C18 column with acetonitrile- methanol- isopropand- water( 57∶ 24∶ 1∶ 18) ， as mobile phase. Detecting wavelength was 212nm； The flow rate was 1. 01ml/min and column temperature was 71℃ . RESULTS： The calibration curve was linear in the concentrations ranged from 40. 2μ g/L to 1 286. 4μ g/L( r=0. 997) . The average recovery was 98. 04% with RSD of 0. 6% ( n=9) . The RSD within day was less than 5. 4% ( n=5) and the RSD between days was less than 6. 2% ( n=5) . CONCLUSION： This method is simple and reliable and can be applied to the monitoring of blood drug concentration in patients receiving transplantation.
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KEY WORDS： RP- HPLC； cyclosporine A； monitoring of drug concentration in blood
环孢素A(CyclosporinA，CsA)是由真菌TolypocladiumInflatumGams分离获得一种天然的亲脂性环十一肽，具有选择性的免疫抑制作用，可有效地抑制器官移植术后的排斥反应[1]。其血药浓度与疗效和毒副作用密切相关。由于CsA的治疗窗口窄，体内过程存在较大的个体差异。因此，需要在治疗过程中进行血药浓度监测。
目前，国内外测定全血中CsA的方法主要有放射免疫法(RIA)、荧光偏振免疫法(FPIA)和高效液相色谱法(HPLC)，因测定原理和专一性不同，各方法下CsA的有效血药浓度各异。HPLC法能特异性测定CsA的全血浓度，能客观地反应CsA在血中的浓度。由于内标物环孢素D难以获得且价格昂贵，所以我们用外标法来监测肝移植患者术后早期全血中CsA的情况。
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1 材料和方法
1.1仪器与试剂：(1)仪器：美国VarianProstar高效液相色谱仪、VarianProstar230泵、VarianProstar310UV检测器；奥特宝恩斯仪器有限公司制造TC-100柱温箱、VarianStarBar工作站。(2)试剂：CsA标准品(华西医科大学器官移植室提供)，甲醇、乙腈、异丙醇均为色谱纯，水为过滤重蒸水，正己烷为分析纯，乙醚重蒸后使用。
1.2色谱条件：YWG-C18(150mm×4.6mm，4.5μm)，流动相：乙腈-甲醇-异丙醇-水(57∶24∶1∶18)，流速：1.0ml/min，柱温：71℃，UV检测波长：212nm，进样量：20μl。
1.3标准溶液制备：精确称量CsA80.4mg，用甲醇溶解，稀释配制成8.04mg/LCsA甲醇标准溶液，贮藏于冰箱备用。
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2 实验结果
2.1色谱行为：见图1～图3。
2.2线性范围及检测限：在具塞离心管中加入不同浓度的CsA标准溶液，50℃水浴挥干后分别加入空白全血1ml，制成CsA浓度分别为40.2、80.4、160.8、321.6、643.2、1286.4μg/L的全血标准液(n=6)，按样品处理项下操作测定，以CsA浓度对色谱峰面积回归，结果表明：在40.2μg/L～1286.4μg/L范围内线性良好，回归方程为：y=225.91X+822.51，r=0.997，n=6。本方法最低检出全血中CsA浓度为40.2μg/L。
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2.3回收率试验：分别取CsA标准液适量及全血1ml，制成浓度为80.4、321.6、1286.4μg/L的CsA全血样品，按样品处理方法抽提后进样，依照此法测定，结果见表1，总平均回收率为98.04%，RSD为0.6%，n=9。x表1CsA回收率测定(±s，n=3)
2.4进样精密度实验：取CsA标准溶液，重复进样5次，根据峰面积值，计算得平均峰面积：A=139366，RSD=3.32%。
2.5稳定性实验：对高、中、低3种浓度的全血标本，分别于1天内(n=5)和1个月(n=5)分散测定，求算日内误差及日间误差，结果见表2。x表2CsA稳定性实验(±s，n=5)
3 讨论
3.1文献报道[2]CsA的代谢物达20多种，HPLC法测定CsA为原形药物浓度，其结果不受代谢物影响，而FPIA法测定则为原形药和代谢物总量，FPIA法测得的血药浓度高于HPLC法1.5倍以上[3]。由于CsA的代谢物毒性目前还不清楚，而且代谢方式根据不同患者(不同疾病、不同治疗)而有差异，因此，HPLC法测定值与药理效应之间具有更好的量效关系[3]。本组建立的HPLC法准确性高，变异小，专一性强，且成本较FPIA法低。
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3.2目前，大多数医疗单位都拥有高效液相色谱仪，而FPIA法所需的TDX仪仅少数医院拥有，且试剂盒价格昂贵，有效期短，检测样品少，极易造成浪费，所以HPLC法特别适合样品少且需开展CsA血药浓度测定的单位。
3.3色谱柱温度是CsA测定中的重要参数，我们曾做过实验，色谱柱在低于70℃时都得不到尖锐对称的CsA峰。采用重蒸乙醚作抽提液，我们观察到最后重组的样品对柱污染小，且对色谱中的峰形有利。加入NaOH液是为了破坏RBC，增加CsA的萃取率。利用CsA在酸性环境下不溶于正己烷这一特性，用正己烷能明显除去全血样品中的杂质干扰物，使色谱图更加清晰。
3.4HPLC法监测CsA治疗的有效全血浓度为100～300μg/L[2]，我们用此法监测了本院开展的3例肝移植病人的血药浓度，其谷浓度均在范围内，很好地控制了病人的排斥反应。摘自：中国药房, http://www.100md.com