盐酸氟桂利嗪片人体生物等效性研究
李扬，王威，刘蕾，史爱欣，赫广威，李可欣，孙春华， 卫生部北京医院临床药理基地，北京市100730
中图分类号:R97 文献标志码:B 文章编号:1001-0408(2000)03-0120-03
摘要：目的：12名健康受试者随机自身交叉口服20mg盐酸氟桂利嗪片和孚瑞尔进行药代动力学和生物等效性研究。方法：采用高效液相色谱荧光检测法，测定血浆中盐酸氟桂利嗪的浓度。结果：经3p97生物利用度计算程序处理拟合，得盐酸氟桂利嗪片和孚瑞尔AUC0～∞分别为(32815±2452)μg/(h·L)和(35193±3586)μg/(h·L)，Cmax分别为(3941±567)μg/L和(3989±339)μg/L，Tmax分别为(256±057)h和(264±052)h，经配对t检验，两者的主要药动学参数均无显著性差异(P>005)。采用梯形法计算的盐酸氟桂利嗪片和孚瑞尔的AUC0～t分别为(36040±2350)μg/(h·L)和(37781±2859)μg/(h·L)。结论：经方差分析和双单侧检验，结果表明，两者具有生物等效性，盐酸氟桂利嗪片剂的相对生物利用度为(957±66)%。
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关键词：盐酸氟桂利嗪；高效液相色谱法；生物等效性
ABSTRACT：OBJECTIVE： The bioequivalence and pharmacokinetics of two kinds of flunarizine hydrocloride tablets were studied in 12 healthy male volunteers METHODS： An oral dose of 20mg of test or reference flunarizine hydrocloride was given according to a randomized 2- way cross- over design， blood samples were withdrawn up to 24 hours post administration， and plasma concentrations of flunarizine hydrocloride were determined by high performance liquid chromatography( HPLC) fluorescence detection RESULTS： Concentration- time curves of two preparations fitted to a one- compartment model The peak plasma levels( Cmax) of flunarizine hydrocloride test drug and reference drug were( 48 71± 5 40) μ g/L and ( 48 83± 4 51) μ g/L respectively， the peak time( Tmax) were( 3 17± 0 39) h and ( 3 13± 0 38) h respectively， and AUC0～ t were( 360 40± 23 50) μ g/( h· L) and( 377 81± 28 59) μ g/( h· L) respectively CONCLUSION： The pharmacokinetics and relative bioavailability data obtained in the study furnished definete proof of bioequivalence of both test and reference flunarizine hydrocloride tablets
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KEY WORDS： flunarizine hydrocloride； HPLC； bioavailability
盐酸氟桂利嗪为哌嗪类钙拮抗剂，对血管平滑肌有扩张作用，用于脑血栓形成、脑栓塞、脑动脉硬化等疾病[1]。本实验采用HPLC方法，对盐酸氟桂利嗪片和孚瑞尔进行生物等效性研究。
1 材料与方法
11 试药及试剂
盐酸氟桂利嗪片，5mg/片，批号9809071，由济南东风制药 厂生产；孚瑞尔(参比品)，6mg/片，批号980602，哈尔滨北方制药厂生产；盐酸氟桂利嗪对照品，河南南阳第二制药厂提供，含量9925%。内标物：对羟基苯甲酸丙酯，由北京化工厂提供，批号970224。试剂：甲醇为色谱纯；水为重蒸馏水；磷酸二氢铵、正己烷为分析纯。
, http://www.100md.com 12 仪器
岛津LC-10AT高效液相色谱系统，RF-10AXL荧光检测器，SP4290积分仪；3p97软件(生物利用度计算程序)，由中国药理学会数学专业委员会编制。
13 受试者
12名健康受试者均为男性，年龄18a～29a，身高167cm～178cm，体重60kg～72kg。受试者在试验前进行体格检查，血常规、肝肾功能、心率、呼吸及血压均正常。受试者试验前2wk及试验期间未服用过其它任何药物。
14 给药方法
采用随机自身交叉方法进行试验设计，12名受试者随机分成两组，清晨空腹口服试药，6名口服盐酸氟桂利嗪片，6名口服孚瑞尔，剂量均为20mg，用温开水100ml吞服。受试者在服药抽血期间忌烟、酒，采血后25h给予低脂肪饮食。12名受试者在服药2wk后自身交叉给药。
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15 血样采集
血样自给药后1、2、25、3、35、4、6、8、12、24h，取上肢静脉血3ml，将血标本置于肝素化的试管中，离心(3000r/min，5min)，分离出血浆，-40℃避光保存至测定。
16 血药浓度的测定[2]
161色谱条件：采用LUNAC18色谱柱，5μm粒径，150mm×46mm；流动相：甲醇∶001mol磷酸二氢铵(3∶1，pH=35)；流速：10ml/min，λex=254nm，λem=308nm；纸速为01cm/min；进样量20μl。
162 标准溶液的配制：精密称取盐酸氟桂利嗪对照品约20mg，置100ml容量瓶中用甲醇溶解，并稀释至刻度，混匀，使成为200mg/L；再精密量取1ml于100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，混匀后成2mg/L的标准贮备液。精密称取对羟基苯甲酸丙酯60mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度；精密量取上述溶液10ml于100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀后成为60mg/L的内标液。
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163 血样的预处理：取血浆样品05ml，置5ml具塞玻璃离心管中，加入内标液100μl，加入甲醇05ml，用涡旋混合器振荡05min，分3次加入正己烷3ml，振荡10min，离心10min，集上清液于另一离心管中，于40℃水浴中氮气吹干，100μl流动相溶解后，取20μl进样。
164 标准曲线的制备：取空白血浆10ml加入盐酸氟桂利嗪标准贮备液(2mg/L)适量，使其成100μg/L浓度，再依次稀释成50、25、125、625、3125、15625μg/L系列浓度，按上述血样处理方法处理后进样测定，记录色谱图、内标峰高(Hi)、样品峰高(Hs)。
165 绝对回收率试验：配制3个浓度的盐酸氟桂利嗪液(分别含盐酸氟桂利嗪50、20、2μg/L)，直接进样20μl，其峰高作为对照组峰高。另取3份空白血浆，各加入适量标准贮备液，处理后使其分别含盐酸氟桂利嗪50、20、2μg/L，进样20μl，将所得峰高与对照组相应浓度峰高比较，计算绝对回收率，并重复测定5次。
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166 方法回收率试验：空白血浆加入盐酸氟桂利嗪标准贮备液使成50、20、2μg/L浓度的样品，按上述血样预处理后进样，由标准曲线求出各样品的浓度与已知加入浓度相比，计算方法回收率，并重复测定5次。
17 数据处理
用3p97程序处理血药浓度数据，参考实测值与理论值的相关性，曲线拟合优度、AIC等指标，选择最优房室模型，求算各药动学参数。
参数用配对t检验进行数理统计分析，用梯形法计算的AUC0～t、Cmax及Tmax进行方差分析和双单侧检验。相对生物利用度(F)按下式计算：
2 结果
21色谱图
在选定的色谱条件下测得的色谱图见图1。由图1可见，血浆中对羟基苯甲酸丙酯和盐酸氟桂利嗪的保留时间分别为527min和731min，峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰。
, 百拇医药
22 标准曲线回归方程
标准曲线测定项下测得Hi及Hs，以R=Hs/Hi计算不同浓度的R，以R对浓度C进行直线回归，得标准曲线回归方程：R=004560+002538C，γ=09998。本方法的最低检测浓度为10μg/L。
23回收率的测定 盐酸氟桂利嗪回收率测定结果见表1。
24 精密度的测定
盐酸氟桂利嗪血药浓度日内、日间精密度测定结果见表2。
25血样测定
12名健康受试者的血药浓度药-时曲线见图2。由图2可以看出，口服盐酸氟桂利嗪和孚瑞尔后3h的实测最高血浆药物浓度均值分别为(4278±506)μg/L和(4102±710)μg/L，24h的血药浓度分别为(365±160)μg/L和(328±126)μg/L，其中最高浓度为6124μg/L，最低浓度为158μg/L，均在本试验线性范围内。
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26药代动力学 经3p97程序处理拟合，其药物动力学模型符合口服给药一室模型。健康受试者口服20mg盐酸氟桂利嗪和孚瑞尔后的药代动力学参数见表3。
2.7 生物利用度
271 三因素方差分析：孚瑞尔为参比，盐酸氟桂利嗪片为供试品，用梯形法计算被试盐酸氟桂利嗪片和参比片剂的生物利用度AUC0～t，结果见表4。被试盐酸氟桂利嗪片的相对生物利用度为(957±66)%。采用三因素方差分析，结果表明，两者的制剂间和周期间无显著性差异(P>005)，说明两药之间具有生物等效性。
272 双单侧检验：t1=7343，t2=11742；查t单侧分数表，t(1～005)(10)=1812，t1>1812，t2>1812，故两药之间具有生物等效性。
3 讨论 本试验建立的荧光检测法灵敏度高、检测限低、选择性强，且采用加甲醇防止正己烷乳化现象的方法，操作简便、杂质峰少，在内标和样品的保留时间处均无干扰峰出现，是盐酸氟桂利嗪的体内药物分析较好的方法。
采用梯形法计算AUC0～t经方差分析，结果表明，制剂间及周期间无显著性差异，说明孚瑞尔和盐酸氟桂利嗪在人体内具有生物等效性。
摘自：中国药房, 百拇医药
中图分类号:R97 文献标志码:B 文章编号:1001-0408(2000)03-0120-03
摘要：目的：12名健康受试者随机自身交叉口服20mg盐酸氟桂利嗪片和孚瑞尔进行药代动力学和生物等效性研究。方法：采用高效液相色谱荧光检测法，测定血浆中盐酸氟桂利嗪的浓度。结果：经3p97生物利用度计算程序处理拟合，得盐酸氟桂利嗪片和孚瑞尔AUC0～∞分别为(32815±2452)μg/(h·L)和(35193±3586)μg/(h·L)，Cmax分别为(3941±567)μg/L和(3989±339)μg/L，Tmax分别为(256±057)h和(264±052)h，经配对t检验，两者的主要药动学参数均无显著性差异(P>005)。采用梯形法计算的盐酸氟桂利嗪片和孚瑞尔的AUC0～t分别为(36040±2350)μg/(h·L)和(37781±2859)μg/(h·L)。结论：经方差分析和双单侧检验，结果表明，两者具有生物等效性，盐酸氟桂利嗪片剂的相对生物利用度为(957±66)%。
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关键词：盐酸氟桂利嗪；高效液相色谱法；生物等效性
ABSTRACT：OBJECTIVE： The bioequivalence and pharmacokinetics of two kinds of flunarizine hydrocloride tablets were studied in 12 healthy male volunteers METHODS： An oral dose of 20mg of test or reference flunarizine hydrocloride was given according to a randomized 2- way cross- over design， blood samples were withdrawn up to 24 hours post administration， and plasma concentrations of flunarizine hydrocloride were determined by high performance liquid chromatography( HPLC) fluorescence detection RESULTS： Concentration- time curves of two preparations fitted to a one- compartment model The peak plasma levels( Cmax) of flunarizine hydrocloride test drug and reference drug were( 48 71± 5 40) μ g/L and ( 48 83± 4 51) μ g/L respectively， the peak time( Tmax) were( 3 17± 0 39) h and ( 3 13± 0 38) h respectively， and AUC0～ t were( 360 40± 23 50) μ g/( h· L) and( 377 81± 28 59) μ g/( h· L) respectively CONCLUSION： The pharmacokinetics and relative bioavailability data obtained in the study furnished definete proof of bioequivalence of both test and reference flunarizine hydrocloride tablets
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KEY WORDS： flunarizine hydrocloride； HPLC； bioavailability
盐酸氟桂利嗪为哌嗪类钙拮抗剂，对血管平滑肌有扩张作用，用于脑血栓形成、脑栓塞、脑动脉硬化等疾病[1]。本实验采用HPLC方法，对盐酸氟桂利嗪片和孚瑞尔进行生物等效性研究。
1 材料与方法
11 试药及试剂
盐酸氟桂利嗪片，5mg/片，批号9809071，由济南东风制药 厂生产；孚瑞尔(参比品)，6mg/片，批号980602，哈尔滨北方制药厂生产；盐酸氟桂利嗪对照品，河南南阳第二制药厂提供，含量9925%。内标物：对羟基苯甲酸丙酯，由北京化工厂提供，批号970224。试剂：甲醇为色谱纯；水为重蒸馏水；磷酸二氢铵、正己烷为分析纯。
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岛津LC-10AT高效液相色谱系统，RF-10AXL荧光检测器，SP4290积分仪；3p97软件(生物利用度计算程序)，由中国药理学会数学专业委员会编制。
13 受试者
12名健康受试者均为男性，年龄18a～29a，身高167cm～178cm，体重60kg～72kg。受试者在试验前进行体格检查，血常规、肝肾功能、心率、呼吸及血压均正常。受试者试验前2wk及试验期间未服用过其它任何药物。
14 给药方法
采用随机自身交叉方法进行试验设计，12名受试者随机分成两组，清晨空腹口服试药，6名口服盐酸氟桂利嗪片，6名口服孚瑞尔，剂量均为20mg，用温开水100ml吞服。受试者在服药抽血期间忌烟、酒，采血后25h给予低脂肪饮食。12名受试者在服药2wk后自身交叉给药。
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15 血样采集
血样自给药后1、2、25、3、35、4、6、8、12、24h，取上肢静脉血3ml，将血标本置于肝素化的试管中，离心(3000r/min，5min)，分离出血浆，-40℃避光保存至测定。
16 血药浓度的测定[2]
161色谱条件：采用LUNAC18色谱柱，5μm粒径，150mm×46mm；流动相：甲醇∶001mol磷酸二氢铵(3∶1，pH=35)；流速：10ml/min，λex=254nm，λem=308nm；纸速为01cm/min；进样量20μl。
162 标准溶液的配制：精密称取盐酸氟桂利嗪对照品约20mg，置100ml容量瓶中用甲醇溶解，并稀释至刻度，混匀，使成为200mg/L；再精密量取1ml于100ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度，混匀后成2mg/L的标准贮备液。精密称取对羟基苯甲酸丙酯60mg于100ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度；精密量取上述溶液10ml于100ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀后成为60mg/L的内标液。
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163 血样的预处理：取血浆样品05ml，置5ml具塞玻璃离心管中，加入内标液100μl，加入甲醇05ml，用涡旋混合器振荡05min，分3次加入正己烷3ml，振荡10min，离心10min，集上清液于另一离心管中，于40℃水浴中氮气吹干，100μl流动相溶解后，取20μl进样。
164 标准曲线的制备：取空白血浆10ml加入盐酸氟桂利嗪标准贮备液(2mg/L)适量，使其成100μg/L浓度，再依次稀释成50、25、125、625、3125、15625μg/L系列浓度，按上述血样处理方法处理后进样测定，记录色谱图、内标峰高(Hi)、样品峰高(Hs)。
165 绝对回收率试验：配制3个浓度的盐酸氟桂利嗪液(分别含盐酸氟桂利嗪50、20、2μg/L)，直接进样20μl，其峰高作为对照组峰高。另取3份空白血浆，各加入适量标准贮备液，处理后使其分别含盐酸氟桂利嗪50、20、2μg/L，进样20μl，将所得峰高与对照组相应浓度峰高比较，计算绝对回收率，并重复测定5次。
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166 方法回收率试验：空白血浆加入盐酸氟桂利嗪标准贮备液使成50、20、2μg/L浓度的样品，按上述血样预处理后进样，由标准曲线求出各样品的浓度与已知加入浓度相比，计算方法回收率，并重复测定5次。
17 数据处理
用3p97程序处理血药浓度数据，参考实测值与理论值的相关性，曲线拟合优度、AIC等指标，选择最优房室模型，求算各药动学参数。
参数用配对t检验进行数理统计分析，用梯形法计算的AUC0～t、Cmax及Tmax进行方差分析和双单侧检验。相对生物利用度(F)按下式计算：
2 结果
21色谱图
在选定的色谱条件下测得的色谱图见图1。由图1可见，血浆中对羟基苯甲酸丙酯和盐酸氟桂利嗪的保留时间分别为527min和731min，峰形良好，分离完全，无杂质峰干扰。
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22 标准曲线回归方程
标准曲线测定项下测得Hi及Hs，以R=Hs/Hi计算不同浓度的R，以R对浓度C进行直线回归，得标准曲线回归方程：R=004560+002538C，γ=09998。本方法的最低检测浓度为10μg/L。
23回收率的测定 盐酸氟桂利嗪回收率测定结果见表1。
24 精密度的测定
盐酸氟桂利嗪血药浓度日内、日间精密度测定结果见表2。
25血样测定
12名健康受试者的血药浓度药-时曲线见图2。由图2可以看出，口服盐酸氟桂利嗪和孚瑞尔后3h的实测最高血浆药物浓度均值分别为(4278±506)μg/L和(4102±710)μg/L，24h的血药浓度分别为(365±160)μg/L和(328±126)μg/L，其中最高浓度为6124μg/L，最低浓度为158μg/L，均在本试验线性范围内。
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26药代动力学 经3p97程序处理拟合，其药物动力学模型符合口服给药一室模型。健康受试者口服20mg盐酸氟桂利嗪和孚瑞尔后的药代动力学参数见表3。
2.7 生物利用度
271 三因素方差分析：孚瑞尔为参比，盐酸氟桂利嗪片为供试品，用梯形法计算被试盐酸氟桂利嗪片和参比片剂的生物利用度AUC0～t，结果见表4。被试盐酸氟桂利嗪片的相对生物利用度为(957±66)%。采用三因素方差分析，结果表明，两者的制剂间和周期间无显著性差异(P>005)，说明两药之间具有生物等效性。
272 双单侧检验：t1=7343，t2=11742；查t单侧分数表，t(1～005)(10)=1812，t1>1812，t2>1812，故两药之间具有生物等效性。
3 讨论 本试验建立的荧光检测法灵敏度高、检测限低、选择性强，且采用加甲醇防止正己烷乳化现象的方法，操作简便、杂质峰少，在内标和样品的保留时间处均无干扰峰出现，是盐酸氟桂利嗪的体内药物分析较好的方法。
采用梯形法计算AUC0～t经方差分析，结果表明，制剂间及周期间无显著性差异，说明孚瑞尔和盐酸氟桂利嗪在人体内具有生物等效性。
摘自：中国药房, 百拇医药