褪黑素抑制低氧引起大鼠大脑皮层氨基酸递质释放*
顾靖；李学君；孙凤艳：上海医科大学基础医学院神经生物学教研室、；医学神经生物学国家重点实验室；上海；200032；孙凤艳：上海生命科学研究中心；上海；200031 顾靖；李学君；孙凤艳
关键词：褪黑素；低氧；脑片；兴奋性氨基酸
摘要：为研究褪黑素对低氧引起大鼠大脑皮层脑片氨基酸释放变化的影响, 利用反相高效液相色谱结合荧光检测法, 测定了孵育液中氨基酸类神经递质的含量。 低氧条件为通入91.6% N2和8.4% O2的混合气体。 低氧30 min时, 大鼠大脑皮层脑片孵育液中, 氨基酸类神经递质天冬氨酸、 谷氨酸、 谷氨酰胺、 甘氨酸、 牛磺酸和γ-氨基丁酸的含量显著增加, 其含量分别是正常氧组的240.4%, 334.3%, 200.6%, 210.4%, 168.6% 和263.9%, 与正常氧组比较 P<0.01。 予以褪黑素可以显著降低兴奋性氨基酸的释放, 其中天冬氨酸和谷氨酸的含量分别是低氧组的55.1% 和57.0%。 结果表明, 褪黑素具有降低低氧所致的脑片释放兴奋性氨基酸的作用。
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褪黑素(melatonin, MT)是由松果体腺分泌的一种重要激素, 具有广泛的生物功能。 近来发现它具有强大的清除自由基的功能[1,2], 而且MT对许多与自由基有关的病理过程(例如脑缺血)所致的损伤有对抗作用[3,4]。
脑缺血可引起神经细胞释放氨基酸, 主要是谷氨酸为代表的兴奋性氨基酸(excitatory amino acids, EAAs), 而EAAs的堆积是脑缺血后神经元损伤的关键环节之一。 EAAs堆积可以促使自由基生成增加[5], 而自由基又可进一步加剧EAAs的积聚[6]。 它们之间可以相互作用而加重缺血后的损伤。 我们以前的工作观察到, MT可以降低低氧所致的脑损伤以及自由基的生成[7]。 在此基础上, 本实验进一步观察了MT对大鼠大脑皮层脑片低氧孵育液中氨基酸类递质含量变化的影响。
药品和试剂 邻苯二甲醛、 四硼酸钠均为国产分析纯试剂; 2-巯基乙酸为Fluka产品; 甲醇、 四氢呋喃均为色谱纯, 英国BDH实验室产品。 褪黑素为分析纯(上海化学试剂厂产品), 由郏其庚教授提供。
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大脑皮层脑片的制备 SD雄性青壮年大鼠, 体重180～220 g, 购自上海医科大学实验动物部。 大鼠断头处死后, 迅速取出大脑置于用95% O2 和5% CO2饱和的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF, 4℃)中。 ACSF的成分为(mmol/L): NaCl 118, KCl 4.8, CaCl2 1.3, MgSO4 1.2, NaHCO3 25, KH2PO4 1.2, Na2EDTA 0.03, 葡萄糖10, pH 7.4。 小心分离出大脑皮层, 用刀片切成2 mm×2 mm×2 mm的薄片, 脑片置于37℃ ACSF中孵育(100 mg脑片: 4 ml ACSF)。
氨基酸的测定 孵育的脑片被随机分为3组: 正常氧组(n=9)、 低氧组(n=9)、 低氧给药组(n=9)。 在脑片开始孵育时, 加入MT(终浓度为4.5 mmol/L) 或配药液(含0.1%无水乙醇的生理盐水)。 5 min后通入91.6% N2 和8.4% O2的混合气体, 造成低氧。 低氧30 min时取孵育液, 保存于-70℃待测定。 样本中氨基酸的含量采用反相高效液相色谱荧光法进行测定[8]。
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统计方法 实验数据均以x±s表示， 组间以t检验进行统计学处理。 以P<0.05为差别有显著意义 。
本文采用HPLC荧光检测法分离和检测脑片孵育液中的氨基酸。 图1显示了HPLC层析的实物分析图, 在此条件下, 同时能检测6种游离氨基酸, 按检测峰的先后, 它们分别是天冬氨酸(Asp)、 谷氨酸(Glu)、 谷氨酰胺(Gln)、 甘氨酸(Gly)、 牛磺酸(Tau)和γ-氨基丁酸(GABA), 其检测的最小灵敏度达10 pmol。 在此条件下, 测定了脑片孵育液中这些氨基酸的含量。 实验结果显示在正常氧浓度孵育的条件下(图1A), 孵育液中氨基酸的含量分别为(μmol/g protein): 1.09±0.58, 2.13±0.72, 4.75±2.48, 2.51±0.95, 5.92±2.59, 2.44±0.97。 而脑片经低氧孵育30 min后(图1B), 其含量分别是: 2.62±1.34, 7.12±3.60, 9.53±2.90, 5.28±2.00, 9.98±3.82, 6.44±2.12 。 由此证明, 低氧可引起脑组织释放氨基酸[9] 。 若在孵育液内预先加入MT, 兴奋性氨基酸升高幅度减小(图1C), 尤其是一些兴奋性氨基酸递质如Glu和Asp, 其浓度仅为单纯低氧孵育液的57.0%和55.1%, 而抑制性氨基酸如Tau、 GABA的浓度则无显著的降低。 本实验结果表明, 低氧引起大鼠大脑皮层释放氨基酸(Asp, Glu, Gln, Gly, Tau和GABA), 而孵育液中预先加入MT (4.5 mmol/L), 可以显著降低低氧所致兴奋性氨基酸的释放(图2)。
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图 1 氨基酸递质分离色谱实物图
Fig.1 Digrams showing HPLC-fluorometric chromatograms
A. Control. B. Hypoxia. C.Hypoxia+MT.
图 2 褪黑素对低氧所致大鼠大脑皮层氨基酸递质释放变化的影响
Fig.2 Decrease of MT (4.5 mmol/L) in the release of amino acid transmitters during hypoxia in rat cortical slice
n=9,x±s,**P<0.01 vs control; +P<0.05 vs hypoxia.
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Glu和Asp是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质。 低氧引起EAAs大量释放, 后者是引起低氧或缺血后神经元损伤的关键环节。 本实验观察到, 在低氧条件下, 大脑皮层孵育液中氨基酸类神经递质释放显著增加, 给予MT后, 大脑皮层兴奋性氨基酸递质(Asp,Glu)释放减少。 结合我们以往的结果, 观察到MT能够抑制缺氧引起的乳酸堆积, 具有明显的细胞保护作用[7], 该作用机制之一可能与MT抑制低氧所致的EAAs释放有关。
作者衷心感谢高慧主管技师的支持和帮助。
*国家自然科学基金资助项目(No.39730170)生理学报，1999年8月，51(4)，445～448
*This work was supported by National Natural Science Foundation of China (No.39730170).
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作者单位：顾 靖 李学君 孙凤艳：上海医科大学基础医学院神经生物学教研室、 医学神经生物学国家重点实验室, 上海 200032;
孙凤艳：上海生命科学研究中心, 上海 200031
参 考 文 献
[1] Tan DX, Chen LD, Pueggeler B, et al. Melatonin: a potent, endogenous hydroxyl radical scavenger. Endocr J, 1993, 1: 57～60.
[2] Pieri C, Marra M, Moroni F, et al. Melatonin: a peroxyl radical scavenger more effective than vitamin E. Life Sci, 1994, 55 (15 suppl): PL-271～276.
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[3] Li XJ (李学君), Zhang LM (张玲妹), Gu J (顾 靖), et al. Melatonin decreases product of hydroxyl radical during cerebral ischemia-reperfusion. Acta Pharmacol Sin (中国药理学报), 1997, 18: 394～396.
[4] Ling X (凌 祥), Zhang LM (张玲妹), Lu SD (陆世铎), et al. Over-expression of bcl-2 is associated with protection of melatonin in neuronal injury following a transient middle cerebral artery occlusion in rats. Acta Pharmacol Sin (中国药理学报), 1999, 20: 409～414.
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[5] Coyle JT, Puttfacken P. Oxidative stress, glutamate and neurodegenerative disorders. Science, 1993, 262 (10): 689～695.
[6] Pellegrini-Giampietro DE, Cherici G, Alesiani M, et al. Excitatory amino acid release from rat hippocampal slice as a consequence of free radical formation. J Neurochem, 1988, 51 (6): 1960～1962.
[7] Li XJ (李学君), Gu J (顾 靖), Pan BS (潘柏申), et al. Effect of melatonin on the production of hydroxyl radical and LDH during anoxia in rat cortical slice. Acta Pharmacol Sin (中国药理学报), 1999, 20: 201～205.
, 百拇医药
[8] Gu YJ (顾拥军), Ni W (倪 文), Bao WL (包维丽), et al. Rapid determination of amino acid neuro～transmitters by RP-HPLC with fluorometric detection. Acta Acad Med Shanghai (上海医科大学学报),1995, 22 (3): 210～212 (in Chinese).
[9] Rothman SM, Olney JW. Glutamate and the pathophysiology of hypoxia-ischemic brain damage. Ann Neurol, 1986, 19: 105～111.
1998-07-21收稿 1998-11-09修回, 百拇医药
关键词：褪黑素；低氧；脑片；兴奋性氨基酸
摘要：为研究褪黑素对低氧引起大鼠大脑皮层脑片氨基酸释放变化的影响, 利用反相高效液相色谱结合荧光检测法, 测定了孵育液中氨基酸类神经递质的含量。 低氧条件为通入91.6% N2和8.4% O2的混合气体。 低氧30 min时, 大鼠大脑皮层脑片孵育液中, 氨基酸类神经递质天冬氨酸、 谷氨酸、 谷氨酰胺、 甘氨酸、 牛磺酸和γ-氨基丁酸的含量显著增加, 其含量分别是正常氧组的240.4%, 334.3%, 200.6%, 210.4%, 168.6% 和263.9%, 与正常氧组比较 P<0.01。 予以褪黑素可以显著降低兴奋性氨基酸的释放, 其中天冬氨酸和谷氨酸的含量分别是低氧组的55.1% 和57.0%。 结果表明, 褪黑素具有降低低氧所致的脑片释放兴奋性氨基酸的作用。
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褪黑素(melatonin, MT)是由松果体腺分泌的一种重要激素, 具有广泛的生物功能。 近来发现它具有强大的清除自由基的功能[1,2], 而且MT对许多与自由基有关的病理过程(例如脑缺血)所致的损伤有对抗作用[3,4]。
脑缺血可引起神经细胞释放氨基酸, 主要是谷氨酸为代表的兴奋性氨基酸(excitatory amino acids, EAAs), 而EAAs的堆积是脑缺血后神经元损伤的关键环节之一。 EAAs堆积可以促使自由基生成增加[5], 而自由基又可进一步加剧EAAs的积聚[6]。 它们之间可以相互作用而加重缺血后的损伤。 我们以前的工作观察到, MT可以降低低氧所致的脑损伤以及自由基的生成[7]。 在此基础上, 本实验进一步观察了MT对大鼠大脑皮层脑片低氧孵育液中氨基酸类递质含量变化的影响。
药品和试剂 邻苯二甲醛、 四硼酸钠均为国产分析纯试剂; 2-巯基乙酸为Fluka产品; 甲醇、 四氢呋喃均为色谱纯, 英国BDH实验室产品。 褪黑素为分析纯(上海化学试剂厂产品), 由郏其庚教授提供。
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大脑皮层脑片的制备 SD雄性青壮年大鼠, 体重180～220 g, 购自上海医科大学实验动物部。 大鼠断头处死后, 迅速取出大脑置于用95% O2 和5% CO2饱和的人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid, ACSF, 4℃)中。 ACSF的成分为(mmol/L): NaCl 118, KCl 4.8, CaCl2 1.3, MgSO4 1.2, NaHCO3 25, KH2PO4 1.2, Na2EDTA 0.03, 葡萄糖10, pH 7.4。 小心分离出大脑皮层, 用刀片切成2 mm×2 mm×2 mm的薄片, 脑片置于37℃ ACSF中孵育(100 mg脑片: 4 ml ACSF)。
氨基酸的测定 孵育的脑片被随机分为3组: 正常氧组(n=9)、 低氧组(n=9)、 低氧给药组(n=9)。 在脑片开始孵育时, 加入MT(终浓度为4.5 mmol/L) 或配药液(含0.1%无水乙醇的生理盐水)。 5 min后通入91.6% N2 和8.4% O2的混合气体, 造成低氧。 低氧30 min时取孵育液, 保存于-70℃待测定。 样本中氨基酸的含量采用反相高效液相色谱荧光法进行测定[8]。
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统计方法 实验数据均以x±s表示， 组间以t检验进行统计学处理。 以P<0.05为差别有显著意义 。
本文采用HPLC荧光检测法分离和检测脑片孵育液中的氨基酸。 图1显示了HPLC层析的实物分析图, 在此条件下, 同时能检测6种游离氨基酸, 按检测峰的先后, 它们分别是天冬氨酸(Asp)、 谷氨酸(Glu)、 谷氨酰胺(Gln)、 甘氨酸(Gly)、 牛磺酸(Tau)和γ-氨基丁酸(GABA), 其检测的最小灵敏度达10 pmol。 在此条件下, 测定了脑片孵育液中这些氨基酸的含量。 实验结果显示在正常氧浓度孵育的条件下(图1A), 孵育液中氨基酸的含量分别为(μmol/g protein): 1.09±0.58, 2.13±0.72, 4.75±2.48, 2.51±0.95, 5.92±2.59, 2.44±0.97。 而脑片经低氧孵育30 min后(图1B), 其含量分别是: 2.62±1.34, 7.12±3.60, 9.53±2.90, 5.28±2.00, 9.98±3.82, 6.44±2.12 。 由此证明, 低氧可引起脑组织释放氨基酸[9] 。 若在孵育液内预先加入MT, 兴奋性氨基酸升高幅度减小(图1C), 尤其是一些兴奋性氨基酸递质如Glu和Asp, 其浓度仅为单纯低氧孵育液的57.0%和55.1%, 而抑制性氨基酸如Tau、 GABA的浓度则无显著的降低。 本实验结果表明, 低氧引起大鼠大脑皮层释放氨基酸(Asp, Glu, Gln, Gly, Tau和GABA), 而孵育液中预先加入MT (4.5 mmol/L), 可以显著降低低氧所致兴奋性氨基酸的释放(图2)。
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图 1 氨基酸递质分离色谱实物图
Fig.1 Digrams showing HPLC-fluorometric chromatograms
A. Control. B. Hypoxia. C.Hypoxia+MT.
图 2 褪黑素对低氧所致大鼠大脑皮层氨基酸递质释放变化的影响
Fig.2 Decrease of MT (4.5 mmol/L) in the release of amino acid transmitters during hypoxia in rat cortical slice
n=9,x±s,**P<0.01 vs control; +P<0.05 vs hypoxia.
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Glu和Asp是中枢神经系统中主要的兴奋性神经递质。 低氧引起EAAs大量释放, 后者是引起低氧或缺血后神经元损伤的关键环节。 本实验观察到, 在低氧条件下, 大脑皮层孵育液中氨基酸类神经递质释放显著增加, 给予MT后, 大脑皮层兴奋性氨基酸递质(Asp,Glu)释放减少。 结合我们以往的结果, 观察到MT能够抑制缺氧引起的乳酸堆积, 具有明显的细胞保护作用[7], 该作用机制之一可能与MT抑制低氧所致的EAAs释放有关。
作者衷心感谢高慧主管技师的支持和帮助。
*国家自然科学基金资助项目(No.39730170)生理学报，1999年8月，51(4)，445～448
*This work was supported by National Natural Science Foundation of China (No.39730170).
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作者单位：顾 靖 李学君 孙凤艳：上海医科大学基础医学院神经生物学教研室、 医学神经生物学国家重点实验室, 上海 200032;
孙凤艳：上海生命科学研究中心, 上海 200031
参 考 文 献
[1] Tan DX, Chen LD, Pueggeler B, et al. Melatonin: a potent, endogenous hydroxyl radical scavenger. Endocr J, 1993, 1: 57～60.
[2] Pieri C, Marra M, Moroni F, et al. Melatonin: a peroxyl radical scavenger more effective than vitamin E. Life Sci, 1994, 55 (15 suppl): PL-271～276.
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[3] Li XJ (李学君), Zhang LM (张玲妹), Gu J (顾 靖), et al. Melatonin decreases product of hydroxyl radical during cerebral ischemia-reperfusion. Acta Pharmacol Sin (中国药理学报), 1997, 18: 394～396.
[4] Ling X (凌 祥), Zhang LM (张玲妹), Lu SD (陆世铎), et al. Over-expression of bcl-2 is associated with protection of melatonin in neuronal injury following a transient middle cerebral artery occlusion in rats. Acta Pharmacol Sin (中国药理学报), 1999, 20: 409～414.
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[5] Coyle JT, Puttfacken P. Oxidative stress, glutamate and neurodegenerative disorders. Science, 1993, 262 (10): 689～695.
[6] Pellegrini-Giampietro DE, Cherici G, Alesiani M, et al. Excitatory amino acid release from rat hippocampal slice as a consequence of free radical formation. J Neurochem, 1988, 51 (6): 1960～1962.
[7] Li XJ (李学君), Gu J (顾 靖), Pan BS (潘柏申), et al. Effect of melatonin on the production of hydroxyl radical and LDH during anoxia in rat cortical slice. Acta Pharmacol Sin (中国药理学报), 1999, 20: 201～205.
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[8] Gu YJ (顾拥军), Ni W (倪 文), Bao WL (包维丽), et al. Rapid determination of amino acid neuro～transmitters by RP-HPLC with fluorometric detection. Acta Acad Med Shanghai (上海医科大学学报),1995, 22 (3): 210～212 (in Chinese).
[9] Rothman SM, Olney JW. Glutamate and the pathophysiology of hypoxia-ischemic brain damage. Ann Neurol, 1986, 19: 105～111.
1998-07-21收稿 1998-11-09修回, 百拇医药