单靠临床表现不能诊断CMV感染，从临床标本中分离出病毒，同时抗体呈出4倍以上增加或持续抗体滴度升高，将有助于诊断。
一、病毒分离
最好用唾液、尿液、生殖道分泌物、乳汁和白细胞，接种到人的成纤维细胞内繁殖和分离，细胞病变效应(CPE)在1天或数周后出现，经固定和HE染色后可观察到巨细胞，核内有内包涵体，核周晕圈及嗜酸性胞浆内包涵体，很象“猫头鹰眼”(owl′s eye)亦可用单克隆或多克隆抗体的荧光染色等方法检查。
二、血清抗体检测
最常用的有补体结合试验(CF)、间接免疫荧光试验(IIF)、免疫酶试验(EIA)、间接血凝试验(IHA)和放射免疫试验(RIA)等检测CMV-IgG和IgM抗体。当单份血清标本已确定既往有CMV感染时，应当立即留血清标本，以及间隔2周、4周、8周再留血清标本，结合病毒分离可作原发感染诊断。
三、DNA探针
已广泛应用于检测CMV，其中以32P标记的探针敏感性最高，对某些标本来说，杂交方法可能比病毒分离更敏感。
四、聚合酶链式反应(PCR)
(一)标本的采集及处理
采集的标本包括患者的血液、尿，以及腺体组织等。由全血制备的血沉棕黄层(buffy coats)可保存于-80℃；尿液标本可保存于液氮中。冻存标本应避免反复冻融。
尿液标本经2500r/min离心10min，以除去细胞碎片，收集上清液。由于尿液中含有PCR抑制剂，因此需用聚乙二醇(PEG6000)进行预处理：50μl尿上清与50μl 20%PEG6000和25μl 2mol/L NaCl混合，置冰浴中6h；15000r/min离心30min收集沉淀。再于6400r/min离心3min；尽可能吸去上清，将沉淀悬浮于蒸馏水中。该悬液可直接用于PCR扩增；扩增时应于100℃加热10min，迅速置冰浴中冷却。
(二)模板DNA的制备
1.由血液标本制备模板DNA
方法A：向血清中加入NaCl使最终浓度为150mmol/L；取10μl 此血清于70℃处理45s后即可直接进行PCR扩增。
方法B：由血沉棕黄层(BCP)制备：① 用PBS洗涤BCP两次，收取沉淀。②加入500μl 6mol/L盐酸胍，匀浆。③ 加入30μl 10mmol/l EDTA，10mmol/L NaCl，30μl20% Sarcosyl和5μl 蛋白酶K(10mg/ml)，混合均匀，60℃反应1h。④加入1130μl 的乙醇，-20℃沉淀1～2h。⑤ 离心收集DNA沉淀。⑥用70%乙醇洗两次，最后将沉淀悬浮于少量10mmol/L Tris-HCl，1mmol/l EDTA中。置4℃备用。
2.由冰冻组织标本制备模板DNA：①用恒冷切片机切取一块5～10μm冰冻组织块，置于1.5ml塑料管中。②加入10%用缓冲液配制的福马林。③ 10min后离心1～2min轻轻倾去上清液，沉淀用乙醇洗2次。④于室温干燥10～60min。⑤ 加入抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，4mmol/l EDTA、pH8.0,400μg/ml蛋白酶K)，使刚好浸没沉淀物(约50～100μl )；将沉淀捣碎。福马林固定的或石蜡包埋组织经脱蜡和干燥后也可按此处理。⑥37℃放置过液。⑦ 置沸水中7min灭活蛋白酶K。⑧离心收集上清，取1～10μl 即可进行PCR扩增。
3.由尿液标本制备模板DNA：①100μl 尿上清液与100μl 6mol/L异硫氰酸胍，7μl 2mol/L NaCl和20μl 玻璃粉悬液(DNa PREP，Asahi Glass Co，Tokyo)混合。② 室温放置10min后，6400r/min离心2min，收集沉淀。③沉淀用50%乙醇，10mmo/L Tris-HCl、pH7.4, 50mmol/L NaCl洗一次，6400r/min离心1min。④同样洗涤沉淀2次，收集沉淀。⑤ 加入50μl 蒸馏水，于55℃作用15min。⑥15000r/min离心2min，收集上清(含HCMV DNA)，进行PCR扩增，将此悬液于100℃加热10min，并迅速于冰浴中冷却。
(三)引物及探针
引物及探针的设计是根据已发表的CMV的直接早期蛋白基因的启动子区和开始的4个外显子序列、晚期抗原gp64基因以及磷酸化蛋白pp71基因序列。常用的引物和探针列在表3中。
(四)PCR扩增步骤
1.10×反应缓冲液：100mmol/L Tris-HCl、pH8.4，500mmol/l KCl，25mmol/L MgCl2，2mg/ml明胶。
Taq DNA 聚合酶：5U/μl 。
10×dNTP：4种dNTP各2.0mmol/L。
引物：100pmol/L。
2.常规PCR扩增
10×反应混合物(50μl)反应缓冲液 5μl
10×dNTP 5μl
模板DNA 5μl
Taq DNA聚合酶 0.2μl (IU)
引物 各0.5μl
蒸馏水 3.8μl
加1～2滴矿物油。
将反应混合物于94℃加热5min；然后于95℃ 30s，55℃40s，72℃ 60s，扩增35～40循环。
表3 CMV PCR扩增所用的引物及探针
| 引物及
探针 | 序列(5′→3′) | 位置 | 片段
大小 |
| IE1 | CCACCCGTGGTGCCAGCTCC | 早期基因 | 159(bp) |
| IE2 | CCCGCTCCTCCTGAGCACCC | ||
| IE3(探针) | CTGGTGTCACCCCCAGAGTCCCCTGTACCCGCGACTATCC | ||
| LA1 | CCGCAACCTGGTGCCCATGG | 晚期gp64 | 139 |
| LA2 | CGTTTGGGTTGCGCAGCGGG | ||
| LA3(探针) | TTCTTCTGGGACGCCAACGACATCTACCGCATCTTCGCCG | ||
| IE1a | AGATCGCCTGGAGACGCCAT | 早期外显子1 | 139 |
| IE1b | GGAATCCGCGTTCCAATGCA | ||
| IE2a | ATGGAGTCCTCTGCCAAGAG | 早期外显子2 | 72 |
| IE2b | CCGTGGCACCTTGGAGGAAG | ||
| IE3a | GTGACCAAGGCCACGACGTT | 早期外显子3 | 167 |
| IE3b | TCTGCCAGGACATCTTTCTC | ||
| IE4a | ACAGATTAAGGTTCGAGTGC | 早期外显子4 | 179 |
| IE4b | CAATACACTTCATCTCCTCG | ||
| IE4c | TTACCAAGAACTCAGCCTTC | 早期外显子4 | 158 |
| IE4d | GTGCGTGAGCACCTTGTCTC | ||
| IE4e | TATACCCAGACGGAAGAGAAATTCA | 早期外显子4 | 426 |
| IE4f | ATAAGCCATAATCTCATCAGGGGAG | ||
| Pp1a | TAGCGCGCATACATCCCGAGTACAT | Pp71基因 | 316 |
| Pp1b | ATGACGTTGCTCCGTGGAAAGAGACC | Pp71 |
3.套式(nested)PCR扩增：①反应混合物的组成同(2)，仅引物为IE2a和IE4b(包括了整个外显子3，共721b)，各100pmol。于94℃60s，52℃150s，72℃ 480s，扩增20循环。② 取2μl 上述扩增产物，各加100pmol的引物IE3a和IE3b补加其他试剂。然后，于94℃60s，52℃150s，72℃180s，扩增20循环。
(五)产物鉴定
扩增产物的分析可采用固相(滤膜)杂交和液相杂交试验。
1. 固相杂交：
① 预杂交液为3×SSPE，5×Denhardt，0.5%SDS和25%甲酰胺.含有扩增产物的滤膜于42℃预杂交30～60min。②加入标记探针(10cpm/μg，2ng/ml)，杂交30～60min。③ 用0.2×SSPE,.01%SDS分别于室温洗涤滤膜3次,5min/次;于60℃洗一次,10min/次;再于室温洗一次以上,5min/次。④自显影。
2. 液相杂交及电泳分析：
① 取1/10体积的扩增产物与0.5～1.0pmol末端记的探针混合。②加入最终浓度为150mmol/L NaCl，10mmol/L磷酸钠及1mmol/L EDTA溶液，使总体积为20μl 。③ 95℃ 10min，然后于56℃ 60min。④ 离心10s加入样品缓冲液，于8%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。⑤电泳毕，用溴化乙锭染色，然后对X线片曝光，自显影。
HCMV DNA分子很大，其碱基序列尚未全部搞清。虽然它的DNA的限制性内切酶片段长度具多形性，但是对其基因组的离散性还不清楚。用单一引物对进行PCR扩增，可鉴定90%的HCMV野型分离株；而采用针对不同HCMV序列的两套以上的引物对，则可检测几乎所有的病毒株。因此，可根据情况使用两对或两对以上的位于基因组不同区域的引物进行PCR检测。
在HCMV模板DNA制备过程中，有时会产生一些小片段DNA，在PCR反应时常导致一定水平的本底产物，从而影响对结果的判定。在这种情况下可采用套式PCR法，其基本原理就是靶DNA的扩增分为两步：首先利用一对引物，扩增包括靶DNA在内的长片段DNA；然后取少量的扩增产物，利用只针对靶DNA的引物再进行第二次扩增。通过控制每步中的扩增循环数，即可防止由小片段DNA引起的假阳性。这种方法也可避免产生假阴性结果。
PCR检测HCMV标本具有很高的敏感性。从HCMV感染的组织培养上清可检测到相当于几十个病毒的DNA分子或1～5PFU病毒的DNA序列。用非放射性寡核苷酸探针进行Southern杂交分析扩增产物，可从尿液标本中检测到1pgHCMv DNA序列的水平；利用该系统，在4×104个细胞中只有一个病毒基因组即可检测出，较斑点印迹杂交提高2×103倍。
PCR技术对HCMV感染的检测具有临床应用价值，因为体液中病毒DNA先于病毒感染的临床症状或血清学证据的出现，可作为HCMV感染的早期指标。由于HCMV可通过胎盘内感染、产道感染等途径传播，而且受感染的新生儿死亡率较高，因此利用PCR进行早期诊断及采取及时的治疗措施，对优生优育也有重要意义。利用这种方法，还可鉴定器官或组织移植手术中供体是否为HCMV与许多严重病症的关系。再者，PCR检测指标稳定，还可进行半定量分析，因此可作为评价各种抗病毒药物疗效的手段。
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