-第一节 光谱分析技术的应用
第一节 光谱分析技术的应用
一、光谱分析技术的分类
利用各种化学物质(包括原子、基团、分子及高分子化合物)所具有的发射、吸收或散射光谱系的特征，来确定其性质、结构或含量的技术，称为光谱分析技术。根据光谱谱系的特征不同，可把光谱分析技术分为发射光谱分析、吸收光谱分析和散射光谱分析三大类。
在临床生化检验中，光谱分析是一类十分重要的技术，应用极为广泛。应用吸收光谱原理进行分析的主要有可见光及紫外光分光光度法，以及原子吸收分光光度法。红外分光光度法虽然也属于吸收光谱法，但在临床生化上应用不多。应用发射光谱原理进行分析的主要有荧光分析法和火焰光度法。应用散射光谱原理进行分析的主要是比浊法，包括免疫比浊法等。
二、光谱分析的常用方法
(一)吸收光谱分析法
1、可见光及紫外光分光光度法
(1)标准曲线法：将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度。
(2)对比法：将标准样品与待测样品在相同条件下显色并测定各自的吸光度。由于测定体系温度、厚度以及入射光波长是一致的，所以标准与待测样品K值及L相等，可应用下式比较计算待测样品浓度：Cx=Cs×As/Ax。
(3)差示法：有色溶液浓度太浓或太稀(透光度超过90%-10%)时，测定结果会产生较大误差，此时可采用差示法(differential spectrophotometry)。①高浓度样液差示法：用标准品制备浓度稍低于试样的参比溶液，先将仪器光门关闭，调节T%=0，再将参比溶液置于光路上，打开光门使T%=100，然后测定样品溶液的透光率即可。例如某一样品溶液原来的透光率读数为5%(10%以下)，用差示法后读数为50%，这实质是把透光率标尺扩展了10倍，从而减少了测量误差。②低浓度样液差示法：用标准品制备浓度稍高于试样的参比溶液，将它放在光路上，打开光门，调节透光率至0%，然后换以空白溶剂，调节刻度至100%。此后测定样品的读数即可。
(4)多组分混合物的测定：当试样中有两种或两种以上的组分共存，可根据各组分的吸收光谱的重叠程度，选用不同的定量方法。如果混合物各组分的吸收峰互不干扰，这时可按单组分的测定方法，选择测定波长，分别测定各组分的含量；若各组分的吸收峰相互重叠，可采用解联立方程法、等吸收点法、双波长法等解决量中的干扰问题。
(5)利用摩尔吸光系数进行检测：①吸光系数：Beer定律的数学表达式为A=kbc，若溶液的浓度c以g/L为单位，b为光径以cm为单位，则常数K称为吸光系数，以a表示，其单位为升/(克·厘米)[L/(g·cm],A=kbc可写成A=abc。②摩尔吸光系数：公式A=kbc中的以为1mol/L,b为1cm时，则系数k称为摩尔吸光系数，以ε表示，单位为升/(摩尔·厘米)[L/(mol·cm)]，A=kbc可写成A=εc。在实际工作中，不能直接用1mol/L这种高浓度的溶液测定吸光度，而是在稀释成适当浓度时测定吸光度进行运算。ε值与入射光波长、溶液的性质等因素有关。如NADH在260nm时ε为15000，写成ε260NADH=15×103；在340nm时ε为6220，写成ε340NADH=6.22×103。③比吸光系数：如公式A=kbc中的c是百分浓度(w/v)b为cm，则常数k可用E%表示，称为比吸光系数或百分吸光系数，A=kbc可写成A=E%bc。当待测物的化学结构是已知者可用ε值分析，若所测物的化学结构是未知的，则ε无法确定，此时用比吸光系数分析就很方便。a、ε和E常用作粗定量分析，主要用于定性分析。
近年来由于新的灵敏度高、选择性好的显色剂和掩蔽剂不断出现，一般不经分离过程即可直接比色测定。几乎所有的无机离子和有机物都可直接或间接用可见光及紫外光分光光度法进行定量测定。
2、原子吸收分光光度法 原子吸收光光度法是基于元素所产生的原子蒸气中，待测元素的基态原子，对所发射的特征谱线的吸收作用进行定量分析的一种技术。具有灵敏度高、选择性好、操作简便、分析速度快等优点，对大部分元素，其灵敏度约为10-8～10-10g/ml，是微量元素检测的一个十分有铲的方法之一。
(1)分析条件的选择
1)分析线：原子吸收法中常选择待测元素的共振作分析线，但并不是任何情况下都应使用共振线，例如As、Se、Hg的共振线在远紫外区，该区域火焰吸收强烈，不宜选用共振线作分析线。在选择分析线时，首先扫描空心阴极灯的发射光谱，然后喷入试样溶液，观察谱线的吸收和干扰情况，一般选用不受干扰且吸收最强的谱线作为分析线。常用元素分析线见表16-1。
表16-1 常用元素分析线
| 元素 | 分析线 | 元素 | 分析线 | 元素 | 分析线 |
| Al | 3093.3082 | Ca | 4227.2309 | Cd | 2288.3261 |
| Cu | 3248.3274 | Fe | 2483.3523 | Hg | 2537 |
| K | 7665.7699 | Mg | 2852.2796 | Na | 5890.3303 |
| Pb | 2167.2833 | Sn | 2246.2796 | Zm | 21393.3076 |
2)狭缝宽度的选择：适宜狭缝宽度可由实验确定：将试样喷入火焰，调节狭缝宽度，测定不同狭缝宽度时的吸光度，达到一定宽度后，吸光度趋于稳定，进一步增加狭缝宽度，当其他谱线或非吸收透过狭缝时，吸光度立即减小。不引起吸光度减小的最大狭缝宽度，就是最适宜的狭缝宽度。
3)原子化条件的选择：对于火焰原子化法，火焰的种类和燃助比的选择是很重要的。当燃气和助燃气选择好后，可通过下述方法选择燃助比：固定助燃气流量，改变燃气流量，测量标准溶液在不同燃助比时的吸光度，绘制吸光度-燃助比关系曲线，以确定最佳燃助比。
对于石墨炉原子化器的使用。应注意干燥是一个低温去溶剂的过程，可在稍低于溶剂沸点的温度下进行。灰化是为了破坏和去除试样基体，故在保证试样无明显损失的前提下，将试样加热到尽可能高的温度。原子化阶段应选择最大吸收信号的最低温度。总之，根据试样的性质确定各阶段所选定的温度与加热时间。
4)试样量的选择：火焰原子化法在一定范围内，喷入的试样量增加，原子吸光度增大，但在超过一定量后，由于试样不能完全有效地原子化及试液的冷却效应会使吸光度不再增大甚至有所下降。因此在保持一定的火焰条件下，测定吸光度随喷入试样量的增加达到最大吸光度时的喷雾量，就是适宜的试样量。石墨炉原子化一般固体取样0.1～10mg，液体取样量为1～50μl，主要依石墨管容器的大小而定。
(2)定量方法：常用的定量方法有标准曲线法、标准加入法和内标法。
1)标准曲线法：同紫外可见标准曲线法。但由于燃气流量和喷雾效率的变化，单色器波长的漂移等因素可导致样品测试条件与标准曲线测定条件不同，所以，在测定未知样品时，应随时对标准曲线进行检查，每次实验都要重新制作标准曲线。
2)标准加入法：在标准曲线法中，一般情况下要求标准溶液和未知溶液的组成保持一致。但在实际工作中不是总能做到的，采用标准加入法可以克服这个缺点。本法把未知试样溶液分成体积相同的若干份，留其中一份，其余分别加入不同量的标准样品，然后测定各溶液的吸光度，以吸光度为纵坐标，标准样品加入量为横坐标绘制标准曲线(图16-1)。由于未知样品中含待测组分，故直线不通过原点而是在吸光度高于原点的A0处与纵轴相交，且直线外推法使工作曲线延长交横轴处于B点，则OB所对应的浓度Cx就是未知试样中待测组分浓度。
图16-1 标准加入法工作曲线
标准加入法的优点是能够更好地消除样品中其它成分对测定的影响。
3)内标法：在系列标准样品和未知样品中加入一定量试样中不存在的元素(内标元素)，然后测得As和Ax，以As/Ax比值对标准样品中待测元素浓度C绘制标准曲线，再根据未加内标元素的试样A与加入内标元素的试样As比值(A/As)即可在标准曲线上求得试样中待测元素浓度。
本法要求内标元素应与待测元素有相近的物理和化学性质。此外，内标法只适用于双通道型原子吸收分光光度计。
(二)发射光谱分析法
1、荧光分析法 许多物质都是光致发光的，即它们可以吸收电磁辐射，然后又重新发射出相同或较长波长的辐射。光致发光最常见的类型是荧光(fluorescence)和磷光(phosphorescence)。利用荧光强度进行分析的方法，称为荧光法(fluorimetry)。在荧光分析中，待测物质分子成为激发态时所吸收的光称为激发光，处于激发态的分子回到基态时所产生的荧光称发射光。荧光法测定的是受光激发后所发射的荧光的强弱，而不是测定激发光的强弱。凡能产生荧光的化合的，均可采用荧光分析法进行定性或定量。
(1)荧光强度的影响因素
1)溶剂：增大溶剂的极性，将使π-π※跃迁的能量降低，荧光增强。在水、乙醇、环已烷等这些常用溶剂中常含有荧光杂质，影响测定，必须在使用前作净化处理。
2)荧光物质的浓度：对于某一荧光物质的稀溶液，在一定频率和一定强度的放射光Ⅰ。照射下，如果光被吸收的百分率不太大，且溶液的浓度很小，当溶液的厚度不变时，则它所发生的荧光强度F和该溶液的浓度C成正比，即F=φⅠ。ECL式中φ为荧效率。当荧光物质浓度高时，会发生分子间碰撞，使荧光效率降低。因为温度增高后使分子间碰撞次数增加，消耗分子的内部能量。
3)温度：大多数情况随温度升高时，荧光效率降低。因为温度增高后使分子间碰撞次数增加，消耗分子的内部能量。
4)溶液的PH值：当荧光物质本身为弱酸或弱碱时，溶液的pH值改变对溶液荧光强度产生影响较大，因为有些物质在离子状态时无荧光，而有些则相反，也有二者均有荧光，但荧光光谱有所不同。
(2)荧光定量分析法：荧光定量分析法通常有标准对比法和标准曲线法。操作和计算可参照比色法，但应注意，空白溶液的荧光强度F。往往不在零点，用上述两种方法时应先测定F，再从标准品Fs和试样Fx中减去F。后进行计算。
多组分混合物在荧光分析也可根据荧光峰相距情况采取不同的方法，如各组分荧光峰相距颇远，可分别在不同波长测定各个组分的荧光强度，然后直接求出各组分浓度。如果各组分荧光光谱相互重叠，利用荧光强度的加和性质，在适宜荧光波长处，测得混合物的荧光强度，再根据被测物质各自在适宜波长处的最大荧光强度，列出联立方程式求算各自的含量。
对较高浓度的荧光物质可用差示荧光法测定。
(3)荧光分析技术的应用：荧光分析法灵敏度高，选择性好、取样量少，因此已广泛应用于各领域，在临床生化检验方面可用于某些无机物与有机物的分析。
无机化合物能直接产生荧光并用于测定的为数不多，但与有机试剂络合后进行荧光分析的元素已达60余种，常见无机物的荧光测定见表16-2。
表16-2 常见无机物的荧光测定
| 元素 | 荧光试剂 | 激发波长(nm) | 荧光波长(nm) | 灵敏度(μg/ml) |
| Ag | 四氯荧光素 | 540 | 580 | 0.1 |
| Al | 桑色素 | 430 | 500 | 0.1 |
| Br | 荧光素 | 440 | 470 | 0.002 |
| Ca | 乙二醛-双-(4-羟苄基腙) | 453 | 523 | 0.0004 |
| Cl | 荧光素+AgNO3 | 254 | 505 | 0.002 |
| CN | 2',7'-双(乙酸基汞)荧光素 | 500 | 650 | 0.1 |
| Fe | 曙红+1，10-二氮杂非 | 540 | 580 | 0.1 |
| Pb | 曙红+1，10-二氮杂非 | 540 | 580 | 0.1 |
| Zn | 8-羟基喹啉 | 365 | 520 | 0.5 |
| F | 石榴茜互R-AI络合物 | 470 | 500 | 0.001 |
某些有机化合物的荧光测定应用较多，如糖类、胺类、甾族化合物、DNA与RNA、酶与辅酶、维生素等。常见有机化合物的荧光测定法见表16-3。
表16-3 常用有机化合物荧光测定法
| 待测物 | 试剂 | 激发波长(nm) | 荧光波长(nm) | 灵敏度(μg/ml) |
| 核酸 | 溴化乙啶 | 360-365 | 580-590 | 0.1 |
| 蛋白质 | 曙红y | 紫外 | 540 | 0.06 |
| 氨基酸 | 氧化酶等 | 315 | 425 | 0.01 |
| 肾上腺素 | 乙二胺 | 420 | 525 | 0.001 |
| NAD(P)H | 自身为荧光物质 | 340 | 450 | 10-6mol/L |
| ATP | 已糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、6-磷酸葡萄糖 | 340 | 450 | 2×10-6mol/L |
| 维生素A | 无水乙醇 | 345 | 490 | 0.001 |
2、火焰光度法火焰光度法是利用火焰中激发态原子回降至基态时发射的光谱强度进行含量分析的方法。它在仪器结构和分析操作上与火焰原子吸收法相似。
在火焰光度法中，试液和助燃气一起进入雾化室，雾化后喷入火焰，雾粒在火焰中蒸发和激发，激发态原子降落到低能态时发生光辐射，经单色器分光后到达检测器，然后由显示系统显示其发射光强度。
试样中的待测元素激发态原子的发射光强度I与该元素浓度C成正比关系，即I=aC。式中a为常数。a与试样的组成、蒸发和激发过程有关。
火焰光度法同样存在各种因素干扰，如供气压力，试样导入量、有机溶剂和无机酸的影响，以及金属元素间的相互作用等，某些干扰因素的消除方法同原子吸收法。对于金属离子间的相互作用可以下述方法予以消除：
(1)阳离子的干扰：第二阳离子的存在可使待测阳离子的电离作用降低而导致以元素形式存在居多，结果发射强度增大，这种现象称为阳离子增强效应。例如测定钙时有钾存在，钾可抑制钙的电离，干扰钙的测定。消除这种干扰的办法是在标准溶液及试样中加入本身易电离的金属如铯和锂。
(2)阴离子干扰：草酸根、磷酸根和硫酸根可与某些阳离子在火焰温度下形成仅能缓慢蒸发的化合物而抑制原子激发，结果导致待测元素发射强度降低。消除这种干扰的办法是用释放剂。释放剂的作用是同干扰阴离子牢固结合，使待测阳离子的激发行为不受干扰，或与待测阳离子形成更稳定而易挥发的配合物。故尽量避免使用磷酸、硫酸、草酸做试剂。
此外，应避免环境污染测试体系。使用的器皿应为塑料制品以防止玻璃器皿中金属溶出干扰测定。
火焰光度法通常采用的定量方法有标准曲线法、标准加入法和内标法。临床检验工作中前两种应用较多，而且测定血液或血清中钠和钾已成常规。应用火焰光度法测定某些元素的波长及检测限见表16-4。
表16-4 火焰光度法测定某些元素的波长与检测限
| 元素 | 测定波长(A) | 检测限(mg/L) | 元素 | 测定波长(A) | 检测限(mg/L) |
| Li | 6708 | 10-4 | Ca | 4227 | 3×10-3 |
| Na | 5890 | 10-4 | Sr | 4607 | 0.02 |
| K | 7665 | 10-3 | Ba | 4934 | 0.2 |
| Rb | 7800 | 0.05 | Mg | 3852 | 0.1 |
| Cs | 8521 | 1.0 |
(三)散射光谱分析法
散射光谱分析法主要测定光线通过溶液混悬颗粒后的光吸收或光散射程度的一类定量方法。测定过程与比色法类同，常用法为比浊法。但颗粒的大小和形状及悬液的稳定性对比浊结果有较大的影响，因此不能完全按比色法的规律进行测定，否则就会引起误差。
1、仪器和测定方法 由于测定仪器和方法的不同，比浊法又可分为散射测浑法(turbidimetry)和浊度测定法(nephelometry)二类。前者利用一般的光电比色计和分光光度计，其原理是利用光线通过混悬溶液时，由于颗粒的散射使通过的光线减弱，根据光线减弱的程度测定溶液中颗粒的浓度，所以，实际上可将散射测浑法看成是比色分析的一种特殊情况。后者则是直接测定混悬溶液中颗粒散射光的强度，由于一般光电比色计中光源和光电管在一直线上，无法测定散射光线的强度，需要特殊的浊度计，如激光比浊仪。测定方法可采用速率法或终点法进行。
速率散射比浊法是一种动力学测定方法，1977年由Seternbery首先用于免疫测定，在一定条件下，抗原和相应的抗体很快结合成抗原抗体免疫复合物颗粒，速率比浊法就是在一定时间内抗原抗体结合过程中，测定二者结合的最大反应速度，即反应达顶峰峰值。终点散射比浊法用于免疫测定时，在一定时间内，通常是抗原抗体反应达到平衡，复合物的浊度不再受时间的影响，但必须在聚合形成絮状沉淀之前进行浊度测定。
2、影响比浊法测定的因素比浊法的突出问题是颗粒的大小对浊度和浊度曲线有较大的影响。因此，在比浊法中必须力求作到：①混悬液中微粒的分散度也就是颗粒的大小应尽可能相同，并易重复。标准管和测定管中颗粒大小应力求一致。②混悬液在一定时间内，至少10分钟内应维持稳定，也就是颗粒应该不易相互聚集，变粗变大。为此，关键在于制备混悬液必须严格控制条件，一般应注意；①沉淀剂或抗体的浓度，一般情况下浊度随其浓度的增高而增大。②混匀方法和速度，一般而言，缓慢加入试剂，逐滴加入，不断摇匀，易产生粗颗粒沉淀；而迅速加入，迅速摇匀，易产生胶态溶液。③温度，温度升高可加快分子间的碰撞，常使某些在室温细小均匀的颗粒易变为粗大的絮状沉淀。④pH溶液，pH可影响沉淀的形成及颗粒的大小，如蛋白质、酶类，在其等电点pH值时最易形成颗粒并沉淀。⑤混悬液的稳定性和测定时间，大多数混悬液随放置时间的延长颗粒变粗而沉淀，吸光度下降，因此应及时比浊。如出现沉淀太快，可以加入保护性胶体，如聚乙烯吡咯烷酮、表面活性剂等，但应注意加入后可能会引起颗粒及光学性质的变化。⑥其它电解质和非电解质存在的干扰。由此可见，比浊法易受外界各种因素的影响，因此在建立一种比浊测定方法时，必须认真探索其反应规律，力求控制各种影响因素以克服比浊法重复性和准确性较差的缺点。
3、比浊法的应用目前在临床生化检验中使用最多的比浊法是免疫比浊法，如免疫球蛋白、载脂蛋白和补体等项目均已大部分用免疫比浊法进行快速定量。
早在1838年Libby等人把比浊法测定就应用到抗原抗体反应上。所谓免疫比浊法是利用抗原和抗体的特异性结合形成复合物，通过测定复合物形成量的多少，对抗原或抗体进行定量的方法。在介质溶液中形成复合物需要一定的条件，包括：①要有特异性抗体。作为组织或体液中蛋白质种类相当多，若要快速特异测定，就需要有单价特异抗体，也就是说，某一种蛋白有其特异抗体才能与该抗原结合，形成免疫复合物，再定量。若抗体不纯或混有另一种或两种少量抗体，这种免疫复合物就不是单一复合物而是大杂烩，结果偏高。②抗原抗体的比例要适当。因免疫复合物的形成有三个阶段，第一阶段是初步形成抗原抗体二元复合物；第二阶段是复合物交联成大的网络状结构；第三阶段是复合物聚合产生絮状沉淀。只有在抗原与抗体等价时即无过剩抗体，此时，复合物的结合和解离处在平衡状态，其混浊程度达高峰，在抗体过量时，随抗原量的增加而复合物的形成也增加，成正比关系，其测定只能在以应曲线的左侧进行。同时，抗原也不能过量，因为抗原过量，则复合物减少，光散射或光吸收就减少，检测结果偏低。③溶液介质适宜，一般要求溶液中有非离子性亲水多聚体促进免疫复合的形成，如聚乙二醇6000等，溶液pH以6.5～8.0之间为宜，离子强度大比小易形成复合物，对离子的种类也有一定的要求。
在免疫比浊过程中，由于抗原与抗体结合有三个阶段，从而导致吸光度与浓度之间不呈线性关系，一般是三次方程曲线关系。如果要将抗原与抗体两个变量之间的变动特征恰当地反映出来，需要经三次方程拟合成近似直线化的曲线方程，再进行运算。方法可采用终点法和速率法，用五个不同浓度进行定标，经三次曲线方程求出一条能反映真实情况的浓度与吸光度的关系曲线方程。作为定量的工作曲线。
三、影响光谱分析的主要因素
光谱分析的基础是被测物质的浓度与吸光度成正比，但在实际测定中，往往容易发生偏离直线的现象而引入误差，导致误差的主要原因有化学因素、主观因素和光学因素等三类。
(一)化学因素
化学因素是指被测溶液不遵守光吸收定律所引起的误差。主要有以下几种影响。
1、被测物浓度的影响由于有色物质的电离、水解、缔合等原因，当溶液稀释或增浓时，有色物质颜色的深浅并不按比例降低或增高，因而也就不完全符合光吸收定律。
2、溶液pH的影响 有些溶液的颜色对pH值的改变十分敏感，因而溶液pH不同时常会产生误差，如溴甲酚绿法测定血清白蛋白。
3、杂质的影响如被测物溶液中含有杂质而且这种杂质本身是有色的，或能和显色剂生成有色化合物或沉淀，或能与被测物质发生化学反应等，都会影响吸光度的变化。
4、放置时间的影响某些有色物质能迅速生成，但却不太稳定，放置后色泽消退或起变化，而另一些有色物质须经过相当长的时间后，反应才能完全，因此，若在不恰当的时间内进行比色，将会造成相当大的误差。
此外，还有溶剂、温度、溶液体系的均匀性等都会引起测定的误差。
(二)主观因素
由于操作不当，特别是在分离、稀释和加显色剂等过程中，没有遵守一定的条件，也会引入不同程度的误差。因为有些有色物质的生成和其颜色的深浅，往往随加入试剂的量、加入顺序、试剂浓度、反应温度和反应时间等因素而发生改变。
(三)光学因素
光学因素主要是指分析仪器的性能低劣所引起的误差，分析仪器应用最多的是分光光度计，它们的性能好坏直接影响到测定结果的可靠性和精密性。因此对分析仪器均应有质量保证措施，这里主要介绍分光光度的质量保证方法。
1、分光光度计的性能检查
(1)波长校正：使用光电比色计或分光光度计，在更换光源灯、重新安装、搬运或检修后，以及仪器工作不正常时，都要进行波长校正。就是正常工作的仪器，每隔一个月也要检查一次波长，必要时进行校正，这样才能保证波长读数与通过样品的波长符合，保证仪器的最大灵敏度。方法常用谱钕滤光片校正法，适用于721型仪可见光区的波长校正，常以585nm或529nm处的吸收峰或T%为标准。鉴于721型仪器的出射光波长较宽，不易将573nm和585nm的两峰或两谷分开，校正时易产生误差，故推荐用529nm处的峰或谷为标准来进行波长校正。校正时，将仪器按要求预热。要求电源电压稳定。波长度盘置580nm处，T%调至最大，在比色杯处放一白纸条，观察是否有光强均匀、边缘无光晕或杂光的光斑，如不符合要求，可调节灯泡位置使其符合要求，是为波长校正的粗调。再把灵敏度扭置于“1”(最低档)，波长度盘对准529nm，电表机械零点为零，在光路空白时调T%为100%T，并反复查零点和100%T稳定情况。将谱钕滤光片插入光路，慢慢旋转波长度盘，找到透光率最低的一点(向左右微旋波长度盘时，该点透光率值均增加)，这一点即为波长529nm。检查波长度盘的指示值是不是529nm，如指示值为534nm，此时波长工误差为5nm，超出规定(±1nm)必须进行调整。
调整方法：将波长度盘对准529nm，从光路取出谱钕滤光片，光路空白时调电表指针到100%T，再将谱钕滤光片插入光路。打开仪器左侧小盖板，找到波长校正螺丝(3个中左侧柄长的一个)；反时针方向微微调节(负误差时顺时针方向)，使电表指针的指示T%为最低。反复检查波长误差情况，直到符合仪器技术指标为止。盖好左侧小盖板，校正结束。
有些高档仪器如岛津UV-260型双光束分光光度计，可使用氢灯或置谱钕滤光片于测定比色槽内，编入滤工扫描程序后，仪器即可自动地在一定波长范围内进行波长校正。高档分光光度仪的光学系统密封在一个单元组件内，若发生故障，波长不准，常须请制造商派专人修理。其它尚有谱线校正法、干涉滤光片校正法和有色溶液校正法等，可参考有关资料。
(2)线性检查：线性检查包括仪器线性及测定方法线性两个方面的检查。线性误差表现为溶液的浓度与吸光度不成线性关系，出现正偏离或负偏离的现象。这种偏离，按比耳定律的现象来自两个方面：一是溶液本身不符合比耳定律，这种现象叫做化学偏离；二是仪器本身各种因素的影响，使吸光度测定值与浓度之间不成线性关系，这种现象叫仪器偏离。此处研究的是后者。仪器偏离的因素很多，如杂光、有限带宽、检测器噪声、环境条件变化、波长的变动、比色杯的误差、辐射光的非平行性、检测器本身的非线性等。
仪器线性检查常用一种在一定波长及一定浓度范围内确知其服从比耳定律的有色物质，配成不同浓度的溶液，来检查仪器本身是否能如实地反映有色物质的浓度变化。这种检查方法与任何被测物质呈色反应等方法学上的问题无关。用测得的吸光度对浓度作图，在理想情况下应是一条直线。常用的方法是用0.8、1.6、2.4、4.0mg/L伊文蓝浓度系列来检查，波长用610nm。
(3)杂光(散光)检查：在吸光度测定中，凡检测器感受到的不需要的辐射都称为杂光。杂光对吸光度测定法的准确性有严重的影响，但却往往被忽视。杂光的来源有：①仪器本身的原因，如单色器的设计、光源的光谱分布、光学原件的老化程度、波带宽度以及仪器内部的反射及散射等；②室内光线过强而漏入仪器，仪器暗室盖不严；③样品本身的原因，如样品有无荧光、样品的散射能力强弱等。
杂光检测方法：①紫外光区的杂光监测可用10±0.1g/L的碘化钠溶液，在240nm处测定的吸光度应大于2.00。此外，也可用12g/L的氯化钾溶液，在220nm处测其透光度，即为杂光量，一般应小于1%T。以上测定均用石英杯，以蒸馏水校零。②在可见光区可使用谱钕滤光片或硫酸镍法检查。先用谱钕滤片校正波长，然后用黑纸片挡住比色杯光路(进口仪器带有比色杯样黑色标柱)之后调整0%T，再用空气做空白调100%T。插入谱钕滤光片，在585nm处测定，其测定值即为杂光水平。
(4)比色杯的质量检查：比色杯一般由玻璃、石英或荧石制成，光径1.0或0.5cm,光线通过时有一部分光为空气与玻璃接触面的反射而损失(4%)，另一部分(很少)为玻璃吸收。比色杯的质量除其原料外，再就是玻璃的厚度均匀，上下一致，各杯彼此相配。厂家多以四个一套供应，且杯口上部外面标有箭头，箭头对光源侧使用。尽管如此，在使用前还是应作质量检查。常用伊文蓝法：将一定量的2.0mg/L的伊文蓝溶液注入比色杯中，比色杯内液面应相等。用一个比色杯作标准，用红色滤光片(波长600～610nm)，用水校零后将此杯的读数准确调至50%T，接着读取其余杯的透光度。透光度相差在±0.5%T范围内者为合格。
(5)稳定性检查：检查方法：将分光光度计及附件接于0.5kVA以上的可调变压器，先调电压为220V，波长固定在650nm，在光路比色杯装以空白液，调读数为90%T处，再将电压升至230V及降至190V，观察透光度的漂移值。若介于88.5%～91.5%T之间为合格。在电源电压不变的条件下，在3分钟内其读数漂移不应超过标尺上限值的±0.5%。
(6)重复性检查：在波长、工作状态、电源电压、比色杯配套等合格的前提下，进行重复检查。在用交流电源供电时，仪器对一种溶液重复测定的读数值差应小于或等于标尺上限值的1%。试验方法：将分析纯重络酸钾于120～150摄氏度烘干2小时，干燥器中冷却。精称509.1mg于1000ml容量瓶中，以蒸馏水溶解并加至刻度，混匀(此液180mg/L铬)。就用液为30、60、180mg铬/L。取波长440nm，将应用液各浓度管连续测3～5次，各浓度管中最大误差小于1%T为合格。
(7)灵敏度检查：将重铬酸钾液配制成30和32.5mg铬/L及120和122.5mg/L铬的4种应用液(浓度差两组各为2.5mg/L铬)。波长440nm，以水校零点，将上述应用液连续测3次吸光度，两组2.5mg/L铬浓度差的吸光度值差都不小于0.01为合格。
2、分光光度计日常工作状态监测在可见光区范围内，用一种有色溶液检查仪器是否处于较好的工作状态(包括波长、杂光水平等)，常用硫酸镍水溶液。该液在400～700nm之间有吸收峰，峰值在510nm。检查时，在400、460、510、550及570nm处测定硫酸镍溶液的透光度值，记录并保存。待一定时间后用该溶液再检测。比较前后两次的数据，即可知仪器的工作状态。
硫酸镍溶液的制备：将硫酸镍溶于0.1%的硫酸中，用量的多少以在510nm测得的透光度达80%T为准，以0.1%硫酸校零点，配好后密封备用。
监测的意义：在400、700nm处的测定可以监测杂光，这些波长处的测定值升高说明杂光增加，其中任一值增加3%就需要进行检修。510nm处的测定值可以监测带宽，这个波长的测定值减小说明带宽加大。光源强度减弱或波长不准可以产生这种结果，如降低2%T，对于带宽为20nm的仪器就需要修理。460与550nm处的读数主要作为监测波长之用，称二次波长校正。这两个波长的读数相互关联，一个升高另一个就降低。如460nm的测定值(透光度)降低，而550nm的测定值升高，说明透过比色杯样品的波长小于波长度盘指示的波长(图16-2左)。反之，如460nm的测定值升高，而550的测定值降低，说明透过比色杯样品的波长大于波长度盘指示的波长(图16-2右)。
图16-2 硫酸镍溶液监测仪器工作状态
实线代表波长正确时的吸收光谱，虚线代表波长不正确时的吸收光谱。箭头1表示510nm处的透光度，左右图均下降；箭头2表示460nm处的透光度，左图下降，右图升高，箭头3表示550处的透光度，左图升高，右图下降。
仪器工作状态测定后，若波长与杂光符合要求时，记录并保存各项数据，以备以后测定时对比。一般应每月监测一次，当400nm及700nm处杂光增强时，可能的原因包括：①激发光源陈旧，变黑或表层模糊不清。②透镜有灰尘。③色散元件失效等。如510nm处透光度减弱，可能原因为光源灯丝故障，比色池出光缝失灵或光栅损坏。
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