本品系由百日咳菌苗原液、精制白喉类毒素及精制破伤风类毒素用氢氧化铝吸附制成。供儿童预防百日咳、白喉及破伤风之用。
1 抗原要求
1.1 百日咳菌苗原液应符合附录1《百日咳菌苗原液制造及检定要求》中2.4项的规定。
1.2 精制白喉类毒素应符合《吸附精制白喉类毒素制造及检定规程》中4项的要求。
1.3 精制破伤风类毒素应符合《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》中4项的要求。
2 制造
2.1 配方
每ml制剂中各种抗原成份含量如下：
百日咳菌45亿～90亿
精制白喉类毒素20Lf
精制破伤风类毒素5Lf
2.2 吸附剂配制，见《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》5项。
2.3 氢氧化铝稀释
以蒸馏水按吸附后之总量将氢氧化铝原液稀释成1.0～1.5mg /ml。硫柳汞含量不超过0.01%(g /ml)，氯化钠含量补足至0.85%(g /ml)，高压蒸汽灭菌。
2.4 吸附
按计算量将精制白喉类毒素、精制破伤风类素及百日咳菌苗原液加入稀释好的吸附剂内。调节pH至5.8～7.2。
2.5 分批
同批吸附剂同批配合的原液同次吸附的制品为1批。如用大罐吸附时，所用抗原和吸附剂可以多批混合(精制类毒素不超过3批)，每罐为1批。
3 成品检定
3.1 物理化学检查
3.1.1 振摇后应呈均匀乳白色混悬液。不应有摇不散的凝块或异物。
3.1.2pH值应为5.8～7.2。
3.1.3 氯化钠含量为0.75%～0.9%(g /ml)。
3.1.4 硫柳汞含量为1.0%～0.5%(mg /ml)。
3.1.5 硫柳汞含量不超过0.01%(g /ml)。
3.2 鉴别试验
抽取样品，另枸橼酸钠或用其他适宜方法将吸附剂溶解后，离心沉淀百日咳菌体和残留的吸附剂，按《吸附精制白喉类毒素制造及检定规程》中7.6项、《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》中7.6项和附录1《百日咳菌苗原液制造及检定要求》中2.4.3项进行鉴别试验。
3.3 无菌试验
按《生物制品无菌试验规程》进行。
3.4 毒性试验
应符合附录1《百日咳菌苗原液制造及检定要求》中2.4.5项的规定。
3.5 安全试验
3.5.1 小白鼠法
用体重18～20g之健康小白鼠5只，每只皮下注射检品0.5ml观察7日，不得有局部脓肿或死亡。
3.5.2 豚鼠法
用体得300～400g豚鼠，每批制品不少于4只，每只皮下注射2.5ml，分两侧，每侧1.25ml，应符合《吸附精制白喉类毒素制造及检定规程》中4.4项及《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》中4.5项要求。
3.6 效力试验
3.6.1 百日咳菌苗免疫力试验
每3批抽1批进行，应符合附录1《百日咳菌苗原液制造及检定要求》中1.2.5项的规定。
3.6.2 白喉及破伤风类毒素的效力试验
每更换1批类毒素时进行。取体重300～400g豚鼠4只，每只皮下注射0.5ml，第30天采血，将分离的血清等量混合，进行白喉及破伤风抗毒素单位测定。
3.6.2.1 白喉抗毒素单位测定
用Lr /300家兔皮内法，要求每ml血清达到0.25IU。
3.6.2.2 破伤风抗毒素单位测定
用L+/100小白鼠皮下法，要求每ml血清达到0.5IU。
3.6.2.3 白喉类毒素的效力试验亦可采用攻毒法。取体重300～350g豚鼠5只以上，每只皮下注射0.5ml。第30天各皮下攻击白喉毒素200个MLD，观察7天，豚鼠死亡不得超过20%；同时另取体重240～270g豚鼠3只，各皮下注射1个MLD毒素作为对照，2只对照豚鼠应发病并于96小时内死亡，允许另1只较晚死亡或发病。
3.6.2.4 亦可按WHO推荐的效力检定方法(见《吸附精制白喉类毒素制造及检定规程》附录和《吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程》附录)。
4 保存与效期
应保存于2～8℃。自吸附之日起效期为1年半。
附录1 百日咳菌苗原液制造及检定要求
本品系用百日咳第Ⅰ相菌种经培育后取菌体制成悬液，加适当杀菌剂，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释制成，每ml含菌45亿～90亿。用于制备百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂。
1 菌种
1.1 制造百日咳菌苗之菌种、检定用的Ⅰ相诊断血清、百日咳分型血清及百日咳参考菌苗，由中国药品生物制品检定所分发或经同意。
1.2 菌种检定
1.2.1 培养特性
于包-姜(Bordet-Gengou)氏或其他适宜的培养基上培育，各菌株应具有典型的形态及生化特性。
1.2.2 血清学特性
将35～37℃培育40～48小时的菌苔，混悬于生理盐水或磷酸盐缓冲生理盐水内，使每ml含菌20亿个，与Ⅰ相血清做定量凝集反应，凝集效价应达到血清原效价之半。同时与单价分型血清做定量凝集反应，其型别应与该菌种标定型别相同。
1.2.3皮肤坏死试验
用健康家兔或豚鼠至少2只，用培育40～48小时的菌苔混悬于磷酸盐缓冲生理盐水内，然后稀释为几个不同浓度的菌液，分别用每一稀释度的菌液注射于家兔或豚鼠的皮内0.1ml，经72小时观察反应。如2只家兔或豚鼠中有1只注射0.4亿个菌以下的菌液部位出现出血性坏死者为阳性反应，判为合格。
1.2.4 毒力试验
用体重16～18g之小白鼠至少3组，每组至少10只，在麻醉状态下从鼻腔滴入经培育40～48小时，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释的菌液0.05ml观察14天，记录小白鼠生死情况，按Reed Muench法计算LD50，LD50菌数不超过1.2亿判为合格。
1.2.5 免疫力试验
1.2.5.1 方法
按附录2《百日咳菌苗原液免疫力试验方法》进行。
1.2.5.2判定
试验菌液每个接种剂量的免疫效价应不少于4.0IU。若试验菌液的效价低于此要求时，可复试，其结果的几何平均值(如用概率分析法时，应用加权几何平均值)≥4.0IU，仍判为合格。
1.3 菌种保存
1.3.1 菌种应用冻干法保存。
1.3.2 冻干菌种应保存在2～8℃。冻干后抽样按1.2项进行检查，合格的菌种可使用2年，以后每年检查1次，如仍合格可继续使用1年。
2. 制造
2.1 制造百日咳菌苗原液至少应选用2个菌株，制成的菌苗应含1、2、3型因子。
2.2 制造百日咳菌苗原液用活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基。如用液体培养基，不得含有已知引起人体毒性或变态反应的成分。
2.3 原液制造
2.3.1 菌种
冻干菌种启开后接种于改良包-姜氏或活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基上。于35～37℃培育不超过72小时，以后各代不超过48小时，传代菌种保存不得超过14天，冻干菌种启开后用于生产时不应超过10代。
2.3.2 培育
可用固体法或液体法培育。培育时间不得超过48小时，经检查为纯菌后，用适当方法收集菌体，混悬于pH值为7.0～7.4的磷酸盐缓冲生理盐水中。
2.3.3 杀菌
原液可用不超过0.1%(ml /ml)甲醛溶液杀菌，放37℃2～3天。亦可用其他适宜的杀菌剂和杀菌方法杀菌。
2.3.4纯菌试验
原液应逐瓶(罐)抽样接种普通琼脂斜面及普通血液琼脂斜面(或活性炭半综合培养基)各1管，放35～37℃培育2天，然后放24～26℃1天。有杂菌生长者应废弃。
2.3.5 原液合并
固体法工艺生产经纯菌试验合格的原液应进行合并。不同菌株不同日期制造2的原液应分别合并。合并后，可加适量防腐剂，并保存于2～8℃。
2.4 原液检定
2.4.1 浓度测定
每瓶原液应按中国细菌浊度标准与质量检定部门会同测定浓度。稀释菌苗时即按此浓度计算。
2.4.2 镜检
每瓶原液取样稀释至成品浓度，涂片染色镜检，应为革兰氏阴性球杆菌。至少观察10个视野，应无杂菌。
2.4.3 凝集反应
每瓶原液按1.2.2项与Ⅰ相血清做定量凝集试验，其凝集效价应达血清原效价之半，如仅达到或低于血清原效价1/4时，应作免疫力试验，合格后方可使用；同时应用单价分型血清做定性凝集试验，其所含型别应与制造原液的菌种型别相同。
2.4.4 无菌试验
每瓶原液除按《生物制品无菌试验规程》进行无菌试验外，并做特异无菌试验。如特异无菌试验有百日咳菌生长，可复试一次，若仍有百日咳菌生长，原液应判为不合格。
2.4.5 毒性试验
2.4.5.1方法
按附录3《百日咳菌苗原液毒性试验方法》进行。
2.4.5.2 判定
试验组小白鼠注射后72小时的总体重不少于注射前总体重，第7天小白鼠增加的体重不少于对照组增加体重的60%，并不得有死亡，该批原液毒性试验判为合格。
试验结果达不到上述要求，可复试一次。仍达到不过要求，可将原液放置1.2.5项方法及要求进行。
2.5 原液保存
应保存于2～8℃。原液自采集之日起至成品发出不得少于4个月。原液自采集之日起效期为3年。
附录2 百日咳菌苗原液免疫力试验方法
1 免疫
1.1 动物
选用体重10～12g同性或雌雄性各半的健康NIH小白鼠。
将动物随机分为三组，每组16只或20只(同性或雌雄性各半，为保证攻击后有16只或20只小白鼠，可适当多免疫几只小白鼠)，同时饲养健康小白鼠55只，备做对照用。
1.2 免疫原稀释
将百日咳原液用生理盐水或pH7.3±0.1磷酸盐缓冲生理盐水稀释至成品菌苗浓度的1/2，然后再稀释7.5×、37.5×、187.5×，百日咳参考菌苗稀释至每ml含8IU，然后再稀释成每ml含1.0IU(0.125ml)、0.2IU(0.025ml)及0.04IU(0.005ml)。
1.3 免疫方法
将不同稀释度的免疫原分别免疫小白鼠，每只小白鼠各腹腔注射0.5ml。
2 攻击菌及攻击菌液的制备
2.1 菌种
小白鼠脑内攻击用58030(18323)菌株。
2.2 培养基
可用包-姜氏培养基(含羊血20%～30%)或其他适宜的培养基。
2.3 培养温度及时间
放35～37℃培育，第一代不超过72小时，攻击时菌种的培育时间为20～24小时。原代菌种放2～8℃可保存2周。
2.4攻击菌液的制备
将培育20～24小时的菌苔经肉眼检查为纯菌后，刮入生理盐水或pH7.3±0.1缓冲生理盐水，用灭菌脱脂棉过滤，测定浓度，然后用pH7.0～7.2水解酷素、蛋白胨水或肉汤稀释成每0.03ml含菌8万，作为试验组的攻击菌液，然后再连续稀释，使每0.03ml分别含8000、800、80及8个菌，以上5个不同稀释度的菌液，作为对照组的攻击菌液。
2.5 工作起止时间
自攻击菌液制备(开始刮菌)至注射完最后1只小白鼠不得超过2.5小时。
2.6活菌计数
在攻击前后，可将0.03ml含8个菌的攻击菌液，接种于包一姜氏培养基或其他适宜的培养基平皿中，每个平皿0.2ml，每次不得少于2个平皿，其菌落形成单位约为浊度测定的1/4。
3 攻击
动物免疫后14天，每只小白鼠脑内攻击0.03ml菌液(含8万个菌)，用0.25ml注射器，4号针头。在试验组攻击后再进行对照组毒力测定，对照组每稀释度攻击10只小白鼠。
4 记录结果
动物攻击后观察14天。攻击后第2天，将试验组动物处理成每组16只或20只。以后逐日观察动物并记录死亡数，最初3天死亡的动物不作统计，至第14天有麻痹、头部肿胀、弓背及明显耸毛的动物按死亡计算。
5 结果计算
5.1 按Wilson-Worcester氏法计算参考菌苗及待检菌苗的ED50±SD%，每个ED50标准差的范围一般应为64%～156%。
5.2 按Reed-Muench氏法计算对照组LD50，1个LD50的菌数应不高于800个菌。
5.3 计算均质性因子“α”。
5.4IU计算
待检原液每ml应含IU=参考菌苗ED50/待检原液ED50×参考菌苗每ml的IU数
6 效力评价
百日咳原液按成品菌苗尝试稀释后，每个接种剂量的免疫效价应不少于4.0IU。
附录3 百日咳菌苗原液毒性试验方法
1 选用体重14～16g健康小白鼠，每批原液不少于10只(同性或雌雄性各半)。
2 以灭菌生理盐水或pH7.3±0.1磷酸盐缓冲生理盐水(含成品菌苗相同量的防腐剂)，将百日咳原液稀释至成品菌苗浓度的1/2。
3 每只小白鼠腹腔注射稀释的原液0.5ml。另取同数量同体重的小白鼠(同性或雌雄性各半)，腹腔注射稀释用生理盐水或pH7.3±0.1磷酸盐缓冲生理盐水0.5ml作为对照。
4 注射后的小白鼠应逐日观察，并于喂食后2小时进行称重。
5 于注射前、注射后72小时及7天，分别称试验组及时对照组小白鼠的体重。
6 试验组小白鼠注射后72小时的总体重不少于注射前的总体重；7天小白鼠平均增加的体重不少于对照组平均增加体重的60%，并不得有死亡，该批原液毒性试验判为合格。
7 试验结果若达不到上述要求，可进行复试，仍达不到上述要求，原液可放置2～8℃保存3～4个月再进行复试，如仍达不到上述要求，该批原液的毒性判为不合格。
吸附百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂使用说明书
本品系由百日咳菌苗原液、精制白喉类毒素及精制破伤风类毒素用氢氧化铝吸附制成。每ml中含百日咳菌8个效力单位，精制白喉类毒素20Lf、精制破伤风类毒素5Lf。供儿童预防百日咳、白喉及破伤风之日。
本品为乳白色悬液，含硫柳汞防腐剂，放置后菌体易下沉，但经振摇后能均匀分散。
接种对象
3个月～6周岁儿童。
用法
1.臀部外上方1/4处或上臂外侧三角肌附着处皮肤经消毒后肌内注射。
2.免疫程序与剂量
自3月龄开始免疫，至12月龄完成三针次免疫，每针间隔4～6周。18～24月龄注射第4针。每次注射剂量为0.5ml。
禁忌
有癫痫、神经系统疾患及抽风史者禁用。急性传染病(包括恢复期)及发热者暂缓注射。
反应
注射本品后，局部可有红肿、疼痛、发痒，或有低热、疲倦、头痛等，一般不须特殊处理即行消退，如有严重反应应及时诊治。
注意事项
1.使用时应充分摇匀，如出现摇不散之凝块，有异物，安瓿有裂纹，制品曾经冻结，标签不清和过期失效者不可使用。
2.注射后，局部可能有硬结，可逐步吸收。注射第2针时应更换另侧部位。
3.应备1∶1000肾上腺素，供偶有发生休克时急救用。
4.注射第一针后出现高热、惊厥等异常情况者，不再注射第二针。
保存
应保存于2～8℃暗处，不得冻结。
, http://www.100md.com