维护血管内皮功能对心脑血管疾病的重要意义——系列研究之六 通心络对实验性家兔主动脉粥样斑块内血管内皮生长因子表达的影响
作者简介：吴宗贵 教授
现任上海长征医院心内科主任，教授、主任医师，博士生导师。中华医学会心血管病分会委员、全军心血管病专业委员会副主任委员、上海医学会理事、上海市心血管病分会副主任委员；担任《国外医学》心血管分册副主编及《中国高血压杂志》、《国际心血管杂志》等编委。
从事心血管疾病的诊断和治疗工作近30年。擅长高脂血症、高血压病、冠心病、心力衰竭和心律失常等的治疗。对心血管领域中疑难危重病的救治亦有较深的造诣。近阶段在研课题有国家重点基础研究(973计划)项目、国家自然科学基金、上海市科委重点科技项目基金等多项研究课题。获得军队科技进步二等奖2项，三等奖4项。发表论著110多篇，主编、副主编出版专著3部，参编8部。
, 百拇医药
在动脉粥样硬化斑块形成的过程中，血管新生(angiogenesis)是其重要的病理学特征之一，早在19世纪70年代即有相关报道，可能有多种生长因子及血管活性物质参与该过程。斑块内血管新生可能导致斑块破裂、出血，引发一系列严重心血管事件，但迄今为止其发生机制及临床意义尚未完全阐明。
血管内皮生长因子(vascukar endothekiak growth factorVEGF)作为迄今为止发现的唯一特异性促进血管内皮细胞有丝分裂的生长因子，在血管新生过程中的作用正越来越受到重视。目前关于VEGF在动脉粥样斑块中表达的报道国外多数为体外实验结果，国内仅有个别此类报道，药物干预对VEGF在动脉粥样斑块中表达的影响尚无报道。
本研究采用高脂肪高胆固醇饲料构建家兔动脉粥样硬化模型，通过免疫组织化学，逆转录聚合酶链式反应及Western Bkot蛋白印迹等方法，从不同水平观察比较纯中药制剂通心络胶囊(吴以岭教授首创运用中医络病理论研制而成的中药复方制剂)及他汀类药物(辛伐他汀)对VEGF在动脉粥样斑块中表达的影响，并结合部分血清学检查，探讨上述药物抗动脉粥样硬化，保护血管内皮功能的作用机制。
, 百拇医药
方法
纯种家兔分别以普通饲料和高脂饲料喂养6周后抽取高脂饮食喂养兔取胸主动脉标本制作病理切片以证实产生粥样硬化斑块高脂饮食喂养家兔随机分为3组：通心络组，每日喂服通心络药液1.0 g/d/Kg；辛伐他汀组，每日喂服辛伐他汀药液2.5 mg/d/Kg；其余高脂饮食喂养家兔为高脂饮食组；普通饲料喂养家兔为空白对照组。家兔继续喂养2周，最终取得完整资料者进入分析。
一.血清学指标的测定
1. 血脂水平的测定：
不同饲料喂养6周及8周后，从兔耳中间动脉收集血样，测定各组家兔血浆总胆固醇 TC，低密度脂蛋白胆固醇LDL-C高密度脂蛋白胆固醇HDL-C和甘油三酯TG的水平。血清氧化低密度脂蛋白ox-LDL含量采用专用酶联免疫试剂盒，抗ox-LDL单克隆抗体及酶标多克隆抗体夹心的方法检测。
, http://www.100md.com
2. 血清一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)和乳酸脱氢酶(LDH)测定：
不同饲料喂养6周及8周后，从耳中间动脉收集血样分别采用NO，NOS，LDH专用检测试剂盒，利用分光光度计通过不同波长吸光度求得血清NO，NOS，LDH含量。
二. VEGF表达的研究：
1. 病理学及免疫组织化学检查：
各组动物处死后，取胸主动脉标本用福尔马林液固定浸泡，石蜡包埋，制作病理切片 利用图象分析软件比较观察不同组家兔血管内膜、中膜厚度及弹力纤维和胶原纤维的分布。
取新鲜的血管组织标本利用VEGF单克隆抗体，按文献报道方法行VEGF免疫组织化学检查。
2. RT-PCR分析：
, http://www.100md.com
各组取新鲜含斑块的家兔胸主动脉标本采用RNA PCR试剂盒，按相应组分配制RT-PCR反应液(包括上下游特异性引物)使用PCR扩增仪，扩增反应按程序循环，产物采用Smartscape生物电泳图象处理系统进一步分析。
3. Westernbkotting蛋白印记分析：
制作各样本蛋白悬液，行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，封闭液中封闭1小时，将膜与第一抗体共同孵育90分钟，接着与辣根过氧化物酶标记的第二抗体共同孵育45分钟，加等体积增强发光化学试剂孵育1分钟，在暗室将膜在感光胶片上曝光并用相纸显影洗像，调整曝光时间直至显影出电泳带，采用生物电泳图象处理系统对上述免疫复合物进一步分析。
结果
1. 血清学指标的测定的结果：
, http://www.100md.com
药物干预前通心络组，辛伐他汀组和高脂饮食组血清TGTCLDL-C水平显著高于空白对照组(P<0.05)，药物干预2周后，通心络组，辛伐他汀组各项血脂水平仍高于正常范围且血清TGTCLDL-C水平显著高于空白对照组(P<0.05)，但该2组血清TGTCLDL-C水平显著低于药物干预前(P<0.05)，HDL-C药物干预前后则未见显著差异(P>0.05)，通心络组，辛伐他汀组组间无显著差异。上述结果说明通心络和辛伐他汀均可降低血清TGTCLDL-C水平。通心络组，辛伐他汀组血清ox-LDL含量显著低于药物干预前。
血清LDH含量结果提示通心络组，辛伐他汀组血清LDH含量显著低于药物干预前以及高脂对照组(P<0.05)，但仍显著高于空白对照组(P<0.05)，两组间则未见显著差异，提示在维持高脂饮食的情况下通心络及辛伐他汀仍具有一定内皮功能保护作用。
2. VEGF表达的研究结果：
, 百拇医药
血管大体观察结果提示：空白对照组家兔主动脉内膜光滑，未见脂纹，通心络组，辛伐他汀组和高脂饮食组均可见不同程度脂纹和粥样斑块隆起，高脂饮食组尤明显。空白对照组8只家兔主动脉内膜完整，中膜外膜分界清楚，通心络组，辛伐他汀组和高脂饮食组与空白对照组比较内膜增厚，透明变性，斑块内可见脂质沉积和大量泡沫细胞，中膜弹力纤维和胶原纤维形态较紊乱，通心络组和辛伐他汀组部分家兔内膜增生程度低于高脂饮食组，中膜弹力纤维和胶原纤维形态优于高脂饮食组。
通心络组，辛伐他汀组和高脂饮食组均可见染成棕黄色的VEGF阳性表达信号，通心络组和辛伐他汀组VEGF阳性表达信号强度明显弱于高脂饮食组，阳性表达信号主要存在于粥样斑块区，细胞内及细胞外间质均有表达，空白对照组家兔主动脉各层则未见VEGF阳性表达。
RT-PCR提示空白对照组无明确产物表达，通心络组，辛伐他汀组仅可见模糊条带，高脂饮食组则呈现强亮度条带，高脂饮食组条带密度分别为通心络组和辛伐他汀组的2.95倍和2.39倍。
, 百拇医药
对照
Westernbkotting蛋白印记分析提示空白对照组无免疫复合物表达，通心络组，辛伐他汀组及高脂饮食组均可见不同密度免疫复合物表达，参照图象分析系统提示高脂饮食组条带密度分别为通心络组和辛伐他汀组的1.26倍和1.21倍。
上述研究结果均提示通心络和辛伐他汀能够明显降低VEGF在家兔主动脉粥样斑块中的表达。
讨论
动脉粥样斑块边缘区有来自外膜新生的毛细血管和来自内膜与冠脉腔直接相通的毛细血管，它们在斑块边缘区吻合形成毛细血管丛，为斑块的滋养血管。由于滋养血管位于斑块边缘区，即正常冠脉壁和斑块之间在血管内血流剪切力的作用或是血管外血管收缩力作用下，斑块边缘区受力最大，加上滋养血管本身与两侧相邻血管壁的顺应性均不相同斑块处的顺应性最差，正常动脉壁的顺应性最佳 使薄壁的滋养血管很容易破裂，造成斑块内出血。滋养血管破裂出血，血液进入内膜可致斑块隆起增大，在内膜下和斑块内形成血栓，使斑块肿胀，加重管腔狭窄。斑块肿胀大到一定程度就会破裂出血，进而形成血栓引发不稳定性心绞痛，心肌梗死等严重心血管事件。
, http://www.100md.com
VEGF是目前所发现的唯一特异性促进血管内皮细胞有丝分裂的生长因子，在血管新生过程中具有重要意义，抑制VEGF在动脉粥样斑块中的表达可一定程度上控制斑块生长进程。本研究通过构建家兔动脉粥样硬化模型，采用免疫组织化学方法，观察比较纯中药制剂通心络及他汀类药物辛伐他汀对VEGF在动脉粥样斑块中表达的影响，结果表明通心络能够明显降低VEGF在家兔主动脉粥样斑块中的表达，RT-PCR分析和Western Bkot蛋白印记分析从mRNA水平和蛋白质水平进一步证实了上述结果。由于VEGF具有特异性促进血管新生之作用，而血管新生可促进动脉粥样硬化之进程，故通心络和辛伐他汀可通过降低VEGF在粥样斑块中的表达实现稳定粥样斑块，延缓动脉粥样硬化进程的作用，这与其它他汀类药物如西立伐他汀可抑制血管新生的报道结果是一致的。
目前亦有大量研究显示在缺血性心脏病过程中，VEGF可刺激侧枝血管形成即所谓的“治疗性血管新生”(therapeutic angiogenesis)，可能有利于缺血性心脏病侧枝循环的建立，该过程亦与其促进血管内皮细胞增殖密切相关。但是，治疗性血管新生的人体实验仅见少数小样本报道，其临床价值尚需进一步探讨，而且粥样斑块组织学类型中高度病变具有更重要的临床意义，集中体现在可能的斑块破裂出血造成恶性心血管事件，所以从临床角度考虑控制斑块进程可能更为重要。VEGF促进血管内皮细胞增殖的不同后果即促进粥样斑块进展和促进侧枝循环之间的动态平衡可能是其临床意义的决定因素。
, http://www.100md.com
实验结果显示通心络和辛伐他汀具有降低血清ox-LDL含量的作用， ox-LDL在动脉粥样硬化的发生发展过程中起着重要的作用，且可促进VEGF在人类内皮细胞和巨噬细胞中的表达，所以我们可以推测通心络和辛伐他汀降低VEGF在家兔主动脉粥样斑块中的表达可能与降低ox-LDL水平具有一定的关系。
LDH含量是体外实验中评价内皮细胞损伤程度的常用指标之一 ，本实验结果表明通心络降低血清LDH含量，亦可从一定程度上提示通心络具有改善血管内皮功能的作用，这可能也是通心络缓解心绞痛的机制之一。
由此可见通心络具有稳定斑块，延缓动脉粥样硬化进程和一定的内皮功能保护作用，这种作用可能是通过多种途径实现的，这可能也是中药复方成分的优势所在。
参考文献(略), 百拇医药(上海长征医院心内科 吴宗贵 张路)