病毒检测谨防误诊
自世界卫生组织(WHO)宣布,SARS病原体为一种新型冠状病毒后,参与全球合作的一些实验室,开始研制各类可用于SARS病毒感染诊断的方法,其中主要有免疫测定法、分子诊断法和病毒培养法等,但目前尚不成熟。因此,如何正确应用并正确解释所获得的结果,对于临床正确诊断SARS,避免误用误诊极为重要。
免疫测定方法主要有免疫荧光试验(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA),均被用于患者血清中特异抗体的检测。要测定血清中的特异抗体,首先要有特异抗原,SARS病毒的基因序列尽管已知,但对其抗原结构仍在紧张的研究之中,目前尚无法采用基因工程表达的特异抗原来建立特异抗体测定的免疫学方法,但由于SARS病毒的培养已不成问题,故在这两个方法中,均应该使用培养的病毒颗粒(用于建立IFA)或其裂解后的成分作为抗原。
免疫荧光试验测定的特异性强,但测定的灵敏度较低,可测到出现症状十多天的SARS病人血清中的特异抗体IgG。它需要使用固定的S ARS病毒颗粒、荧光显微镜和有经验的实验技术人员。抗体阳性表示病人感染了SARS病毒。
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用ELISA方法从出现症状和体征十多天起,检测SARS病人血清中的抗体是可靠的。目前也有报道可以测定特异的抗体IgM。IgM抗体的出现要早于IgG,可使感染检测提前数天。但要注意,由于目前ELISA 方法使用的抗原,是裂解的病毒颗粒成分,而该病毒是否与已知冠状病毒科病毒有共同成分或同源性有多大,还是未知数,故很有可能会出现假阳性,并且很可能是这种方法的致命弱点。
分子诊断方法由于SARS病毒的核酸序列已经明确,WHO也公布了非常关键的相应的病毒核酸扩增检测的七对引物,这些引物已被世界上很多国家采用,因此国内外迅速建立了SARS病毒的反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法,可以检测患者或疑似患者不同标本(血液、粪便、呼吸道分泌物或身体组织)中的SARS病毒。通常病毒感染后,在感染者体液中最先会有病毒颗粒的存在,血循环中特异抗体的出现会晚很多天,故RT-PCR方法可用于病毒感染的早期诊断及疑似感染者的确诊。现在已经有了可以直接使用的含有引物、阴性质控和阳性质控的检测试剂盒。国内也有了SARS病毒检测的荧光RT-PCR试剂盒。现有的RT-PCR检测非常特,但灵敏度仍不是太高。
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再则,目前已有的RT-PCR方法所扩增的核酸片段,不一定为所有SARS病毒所共有,这意味着RT-PCR诊断实验的阴性结果并不能说明没有SARS病毒,也不能排除病人携带SARS病毒的可能性。
进行上述有关SARS病毒感染的实验室检测,必须有质量控制措施,与其他实验室的结果进行比较。对于阳性结果必须按照一个严格的程序进行确认,尤其是在低感染流行地区,因为其阳性预示值较低。RT -PCR检测在每次均要包括适当的阳性和阴性质控物,并同时对每一份患者标本做一份平行样本检测。如果RT-PCR检测为阳性,则应该进行下述实验确认:(1)对同一份原始标本进行重复实验,(2)扩增病毒的第二个基因组区域,或在另一个实验室对同一份标本进行检测。
病毒培养在普通的临床实验室难以进行,但它是惟一能证实活病毒存在的方法。阳性检测结果:为SARS病人或最近感染过SARS病毒。但要注意假阳性问题。
阴性检测结果:一个阴性的SARS病毒检测结果并不意味着病人没有感染SARS。阴性结果的解释是:(1)病人并未感染SARS病毒,该疾病由其他传染源(病毒、细菌、真菌)或非感染源引起。(2)假阴性。因为方法的检测灵敏度不够,或是病毒基因型的差异,或PCR 引物的局限性。(3)标本没有在病毒或核酸物质可能存在的时间内采集(特指PCR和细胞培养)。(4)标本在疾病的早期采集并且在抗体产生之前(特指ELISA和免疫荧光测定)。
WHO建议用于检测的SARS病人标本的收集和储存应是连续的,这样可以使诊断性检测变得直接而有效。这对于没有报道SARS的国家或地区首位病人的识别尤其重要。
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免疫测定方法主要有免疫荧光试验(IFA)和酶联免疫吸附试验(ELISA),均被用于患者血清中特异抗体的检测。要测定血清中的特异抗体,首先要有特异抗原,SARS病毒的基因序列尽管已知,但对其抗原结构仍在紧张的研究之中,目前尚无法采用基因工程表达的特异抗原来建立特异抗体测定的免疫学方法,但由于SARS病毒的培养已不成问题,故在这两个方法中,均应该使用培养的病毒颗粒(用于建立IFA)或其裂解后的成分作为抗原。
免疫荧光试验测定的特异性强,但测定的灵敏度较低,可测到出现症状十多天的SARS病人血清中的特异抗体IgG。它需要使用固定的S ARS病毒颗粒、荧光显微镜和有经验的实验技术人员。抗体阳性表示病人感染了SARS病毒。
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用ELISA方法从出现症状和体征十多天起,检测SARS病人血清中的抗体是可靠的。目前也有报道可以测定特异的抗体IgM。IgM抗体的出现要早于IgG,可使感染检测提前数天。但要注意,由于目前ELISA 方法使用的抗原,是裂解的病毒颗粒成分,而该病毒是否与已知冠状病毒科病毒有共同成分或同源性有多大,还是未知数,故很有可能会出现假阳性,并且很可能是这种方法的致命弱点。
分子诊断方法由于SARS病毒的核酸序列已经明确,WHO也公布了非常关键的相应的病毒核酸扩增检测的七对引物,这些引物已被世界上很多国家采用,因此国内外迅速建立了SARS病毒的反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法,可以检测患者或疑似患者不同标本(血液、粪便、呼吸道分泌物或身体组织)中的SARS病毒。通常病毒感染后,在感染者体液中最先会有病毒颗粒的存在,血循环中特异抗体的出现会晚很多天,故RT-PCR方法可用于病毒感染的早期诊断及疑似感染者的确诊。现在已经有了可以直接使用的含有引物、阴性质控和阳性质控的检测试剂盒。国内也有了SARS病毒检测的荧光RT-PCR试剂盒。现有的RT-PCR检测非常特,但灵敏度仍不是太高。
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再则,目前已有的RT-PCR方法所扩增的核酸片段,不一定为所有SARS病毒所共有,这意味着RT-PCR诊断实验的阴性结果并不能说明没有SARS病毒,也不能排除病人携带SARS病毒的可能性。
进行上述有关SARS病毒感染的实验室检测,必须有质量控制措施,与其他实验室的结果进行比较。对于阳性结果必须按照一个严格的程序进行确认,尤其是在低感染流行地区,因为其阳性预示值较低。RT -PCR检测在每次均要包括适当的阳性和阴性质控物,并同时对每一份患者标本做一份平行样本检测。如果RT-PCR检测为阳性,则应该进行下述实验确认:(1)对同一份原始标本进行重复实验,(2)扩增病毒的第二个基因组区域,或在另一个实验室对同一份标本进行检测。
病毒培养在普通的临床实验室难以进行,但它是惟一能证实活病毒存在的方法。阳性检测结果:为SARS病人或最近感染过SARS病毒。但要注意假阳性问题。
阴性检测结果:一个阴性的SARS病毒检测结果并不意味着病人没有感染SARS。阴性结果的解释是:(1)病人并未感染SARS病毒,该疾病由其他传染源(病毒、细菌、真菌)或非感染源引起。(2)假阴性。因为方法的检测灵敏度不够,或是病毒基因型的差异,或PCR 引物的局限性。(3)标本没有在病毒或核酸物质可能存在的时间内采集(特指PCR和细胞培养)。(4)标本在疾病的早期采集并且在抗体产生之前(特指ELISA和免疫荧光测定)。
WHO建议用于检测的SARS病人标本的收集和储存应是连续的,这样可以使诊断性检测变得直接而有效。这对于没有报道SARS的国家或地区首位病人的识别尤其重要。
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