拉咪呋定长期治疗引起HBV DNA YMDD变异的研究
闵 佳 李 卓 郝 娃 林尊慧 靳海英 北京佑安医院 100054
乙型肝炎病毒感染导致的肝炎，发展为慢性肝炎、肝炎后肝硬化、肝细胞性肝癌。新一代核苷类抗病毒药物，如拉咪呋定、法昔洛韦等治疗HBV感染，日益受到重视，它可以插入新的病毒DNA链中，抑制HBVDNA聚合酶的活性，从而阻止了HBVDNA的合成，使得HBV DNA转阴。但是，在治疗过程中，部分病人出现血清HBVDNA聚合酶基因区的保守序列YMDD(络氨酸一蛋氨酸一天冬氨酸一天冬氨酸)基因变异，其中最常见编码蛋氨酸的552位点出现了核苷酸的替代，目前已经报道的主要有两种常见的变异形式即M552V、M5521对治疗产生了耐药。为了建立一种快速，简便，经济，特异的检测HBVDNA变异的方法，研究拉咪呋定治疗过程中出现的HBV基因变异的问题，我们利用限制性片断长度多态性分析方法作了如下研究。
材料与方法
1.研究对象：240例拉咪呋定(100mR/日口服)治疗的慢性乙型肝炎病人血清标本，收集自北京佑安医院门诊及住院病人。
, 百拇医药
2.方法：设计错配引物应用巢式PCRRFLP方法扩增HBVDNA，由于YMDD基因区没有任何酶切位点，在引物设计中引人Nde I和NLaⅢ酶切位点，参照Mrchelle的方法。
3.HBV DNA纯化：采用常规蛋白酶K消化，酚抽提的方法。
4.HBV DNA外引物扩增位点：50ul反应体积中含有10 XPCR缓冲液5ul，P1，R1引物各0.5ul，dNTP各200mM，Taq酶2u，模板20ul，循环反应条件94~C，5min；94℃，45s；55~C，45s；72℃，45s；共35个循环72~C，7rain延伸。扩增552位点：PCR循环加入F2、R2引物各0.5ul，其它条件与以上相同。扩增528位点：取第一次PCR产物10ul，F3，R2引物各0.5ul，余条件与以上相同。分别取552、528位点扩增产物lOul，2%琼脂糖凝胶电泳后，紫外透射分析仪观察结果。HBV DNAPCR阳性的产物进行酶切分析。
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5.限制性内切酶分析：10ul酶切反应体系中含有Ndel2ul，(或NLaⅢ)酶切缓冲液2ul，产物6ul；37消化1小时。紫外透射分析观察结果。
6.HBVDNA定量PCR测定：AG9600定量基因扩增仪，HBVDNA定量PCR检测试剂(AcuGenHBVQuantitativeTest)美国Biotronics公司提供，按操作说明书规定进行操作，HBV DNA水平用每m1血清HBV DNA模板起始拷贝数表示，测定的临界值为1X104。
7.HBV克隆测序：三例PCR扩增阳性产物(RLFP方法分析为野毒株一例、M552V伴L528M变异1例、M5521变异1例)经低熔点琼脂糖纯化后，在连接酶作用下与载体PGEM—T Vector(美国Promega公司)在16'12水浴连接过夜，转化Top大肠杆菌。在IPTG和X—gal存在的条件下，挑取含有目的基因片断的白斑，用PCR方法鉴定阳性克隆后，进行基因测序分析。
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结 果
一、YMDD变异测定结果
240例拉咪呋定治疗的慢性乙型肝炎病人血清测定HBVDNAYMDD，其中51例发生变异。
1.552位点变异(用PCR—RFLP方法，引物F2、R2扩增产物经酶切分析)：在拉咪呋定治疗中HBVD-NA聚合酶YMDD位点产生了变异，使得HBV DNA的原靶序列ATG发生了变化，引入的NdeI酶切位点缺失，从而产生119bp的变异株条带；在野毒株中引入的酶切位点存在并可以被酶消化切开，所以产生了99bb和20bp个的两个片段，20bp的小片段与引物带参杂在一起。
2.M552V变异：在确定了是YMDD变异后进一步分析是M552V、M5521变异，可以用NlaⅢ酶切，M552V变异，能够被此酶切开，DNA片段成为95bp和24bp的两个片段。
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3.528位点变异：除了YMDD变异以外，还存在DNA聚合酶B区528位点的变异，它是由528位亮氨 酸被蛋氨酸取代(1528M，用引物F3，R2扩增，产物是197bp，引入NLaⅢ酶切位点，如果是L552M变异，可以将其切开，形成176和22bp大小两个片段。
4.拉咪呋定治疗240例慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA变异的情况：240例拉咪呋定治疗的慢性乙型肝炎患者52—78周，发生血清HBVDNA变异的共51例，其中M552V变异38例，M5521变异13例L528M变异27例；M522V变异同时有L528M变异的有26例，M5521变异同时有L528M变异的1例。在552位点单一基因变异的只有24例。
二、HBV DNA定量分析与YMDD变异的关系
慢性乙型肝炎病人服用拉咪呋定后HBADNA迅速下降到检测水平以下，当发生耐药基因突变时HBVDNA反跳240例患者中51例发生YMDD变异，患者血清HBV DNA定量分析与HBV DNA变异的比较
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见表1。
表1 HBV DNA定量分析与YMD变异的关系
TablThecorrelationbetweetheHBV DNA QuantitativePCRassayand'hemutationOfYMDD51例患者血清HBVDAN变异，DNA水平升高，但是70.58%患者(36/51)其DNA水平仍在1X105以下，高水平复制HBV DNA≥1X 108为13.72%(7/51)。HBVDNA测序法比较：用DNA序列分析检测验证RFLP方法是否可行，对三例标本进行了测序，2例检出YMDD变异，(其中1例为YVDD，伴有L528M变异，1例为YIDD变异)l例是野毒株(见表2)。
表2 3例患者核耷酸序列测定编码的HBVP基因区氨基酸序列
Table 2 HBV P gene range aminO acids sequence in 3 patients
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FRKTPMGVGLSPFLLAQFTS AECSVVRRAFPHCLAFSYM D DVVLGAKSVQHL
三、ALT水平变化与YMDD变异的关系
51例发生YHDD变异的患者在治疗52周-78周时34例ALT上水平明显高于无变异患者组(52周76.7+27.9L匕27.9+10.1，P：0.001；78周66.7+57.6L匕27，3+21.2，P：0.001)，治疗52周时，23例变异的患者中16例ALT升高，2例病人高于治疗前水平，伴血清胆红素升高，因而再次住院治疗。治疗78周时，28例变异患者中18例ALT升高，不论HBVDNA变异发生在什么时期，其血清ALT升高水平比较无明显差异。17例虽然发生YMDD变异，但未见血清ALT升高。
讨 论
拉咪呋定用于慢性乙型肝炎抗病毒治疗，日益受到病人的接受，但随着用药时间的延长，耐药变异株的出现也引起临床的重视。
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PCR限制性片段长度多态性分析方法测定HBV DNA YMDD变异是一种快速、经济。简单易行的方
法，国内外已有文献报道。
Cane等对8例慢性乙型肝炎患者给予拉咪呋定口服治疗，5/8例在治疗40-56周发生乙型肝炎突发，但是病毒滴度低于治疗前水平，分析HBV DNA聚合酶变异发现4/8M522V变异，4/8M5221变异，在4例M552V变异中均有L528M变异。作者认为M552V位于C区，L528M位于B区，M552V和L528M联合变异，说明了C区和B区在功能和结构上相互作用，HBV聚合酶在药物的作用下不断的选择调整，使病毒具有高复制水平。
Alleb等报道20例用拉咪呋定治疗导致乙型肝炎突发的患者，通过基因序列分析发现，所有患者都存在YWDD区变异，根据不同的变异形式分成两组，第一组18例患者均出现M552V变异和L528M变异，第二组2例出现M5521变异。
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在我国进行的拉咪呋定临床试验已经完成了三期观察，先后有一些临床报道其结果表明12.1(的患者治疗48周后出现YMDD变异)。张欣欣等报道19例拉咪呋定治疗的病人48周时HBV DAN变异，其中2例伴有ALT升高；1例治疗过程中HBV DNA从未阴转，ALT波动于正常值以下，且发生多聚酶其他部位的变异。另有报道拉咪呋定治疗2年的观察：52周和104周YMDD的变异率为13.7、39.7%。
发生变异后大部分HBV DNA水平升高或持续不降。ALT水平明显高于无变异组。在变异组中52周时有50%的患者发生ALT反跳，即高于治疗前水平，104周时有34.8%的患者发生ALT反跳。姚光弼等报道，治疗52周结束时发生YMDD变异的48例患者中，20例在治疗48周时HBV DNA转阳，仅6例(12.5%)高于治疗前水平。37例在治疗38周时ALT正常，11例升高，其中6例高于治疗前水平。我们在研究拉咪呋定治疗HBV感染的240例慢性乙型肝炎患者中发现，用药52-78周(1-1.5年)51(21，25%)例出现HBVDNA聚合酶变异，其中M552V变异38(74.5%)例，M5521变异13(25.49%)例，M552V和L528M同时出现变异26(50.89%)例，出现变异的时间为治疗12个月以上。发生变异的患者血清HBVDNA含量70.58%在105以下，仅一例为109。由于HBVDNA聚合酶变异发生在拉咪呋定作用位点，并且在治疗后出现，说明该变异与药物治疗有关，其结果是直接影响拉咪呋定的疗效，但发生变异以后病毒的复制能力较低，因此多数患者血清HBV DNA仍然在较低水平。用RFLP方法检测为1例野毒株，1例M552V变异伴有L528M变异，1例M5521为异的3例标本，经基因序列分析得到同样的结果，说明RLFP
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方法可以用于检测HBVDNA变异。应用拉咪呋定治疗发生YMDD变异后，即使出现ALT水平升高，但仍低于用药前水平，Albert报道了33例与耐药变异相关的急性肝功能失代偿，表明出现耐药株病情急性恶化时可能发展为肝衰竭，但是多数病人ALT轻微升高。我们在观察中也发现变异患者的ALT水平高于无变异患者组，但是尚未有肝脏功能失代偿的临床表现，这可能是由于变异病毒致病力的改变所造成的免疫反应与肝细胞损伤有关，应密切观察随访，了解患者发生变异后的转归。
HBV长期在人群中感染和传播，受到宿主免疫系统和抗病毒药物的拮抗作用等因素的影响，可能产生HBVDNA序列的变异，逃避人体的免疫，继续复制、生长繁殖。HBV虽然不引起肝细胞的直接病变，但是肝脏损害是病毒持续启动复制和诱发机体免疫清除作用造成的，因此，对慢性乙型肝炎患者的综合治疗的同时，着重抗病毒治疗是重要的方案。拉咪呋定做为一类新的抗病毒药物，通过抑制HBV DNA聚合酶的活性，发挥其抗HBV的作用，具有一定的疗效，但是，在治疗中容易产生病毒变异。因此，在拉咪呋定治疗过程中，监视病人体内HBVDNA的变异情况，有助于了解病人机体内病毒复制的情况，以便观察疗效。, http://www.100md.com
乙型肝炎病毒感染导致的肝炎，发展为慢性肝炎、肝炎后肝硬化、肝细胞性肝癌。新一代核苷类抗病毒药物，如拉咪呋定、法昔洛韦等治疗HBV感染，日益受到重视，它可以插入新的病毒DNA链中，抑制HBVDNA聚合酶的活性，从而阻止了HBVDNA的合成，使得HBV DNA转阴。但是，在治疗过程中，部分病人出现血清HBVDNA聚合酶基因区的保守序列YMDD(络氨酸一蛋氨酸一天冬氨酸一天冬氨酸)基因变异，其中最常见编码蛋氨酸的552位点出现了核苷酸的替代，目前已经报道的主要有两种常见的变异形式即M552V、M5521对治疗产生了耐药。为了建立一种快速，简便，经济，特异的检测HBVDNA变异的方法，研究拉咪呋定治疗过程中出现的HBV基因变异的问题，我们利用限制性片断长度多态性分析方法作了如下研究。
材料与方法
1.研究对象：240例拉咪呋定(100mR/日口服)治疗的慢性乙型肝炎病人血清标本，收集自北京佑安医院门诊及住院病人。
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2.方法：设计错配引物应用巢式PCRRFLP方法扩增HBVDNA，由于YMDD基因区没有任何酶切位点，在引物设计中引人Nde I和NLaⅢ酶切位点，参照Mrchelle的方法。
3.HBV DNA纯化：采用常规蛋白酶K消化，酚抽提的方法。
4.HBV DNA外引物扩增位点：50ul反应体积中含有10 XPCR缓冲液5ul，P1，R1引物各0.5ul，dNTP各200mM，Taq酶2u，模板20ul，循环反应条件94~C，5min；94℃，45s；55~C，45s；72℃，45s；共35个循环72~C，7rain延伸。扩增552位点：PCR循环加入F2、R2引物各0.5ul，其它条件与以上相同。扩增528位点：取第一次PCR产物10ul，F3，R2引物各0.5ul，余条件与以上相同。分别取552、528位点扩增产物lOul，2%琼脂糖凝胶电泳后，紫外透射分析仪观察结果。HBV DNAPCR阳性的产物进行酶切分析。
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5.限制性内切酶分析：10ul酶切反应体系中含有Ndel2ul，(或NLaⅢ)酶切缓冲液2ul，产物6ul；37消化1小时。紫外透射分析观察结果。
6.HBVDNA定量PCR测定：AG9600定量基因扩增仪，HBVDNA定量PCR检测试剂(AcuGenHBVQuantitativeTest)美国Biotronics公司提供，按操作说明书规定进行操作，HBV DNA水平用每m1血清HBV DNA模板起始拷贝数表示，测定的临界值为1X104。
7.HBV克隆测序：三例PCR扩增阳性产物(RLFP方法分析为野毒株一例、M552V伴L528M变异1例、M5521变异1例)经低熔点琼脂糖纯化后，在连接酶作用下与载体PGEM—T Vector(美国Promega公司)在16'12水浴连接过夜，转化Top大肠杆菌。在IPTG和X—gal存在的条件下，挑取含有目的基因片断的白斑，用PCR方法鉴定阳性克隆后，进行基因测序分析。
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结 果
一、YMDD变异测定结果
240例拉咪呋定治疗的慢性乙型肝炎病人血清测定HBVDNAYMDD，其中51例发生变异。
1.552位点变异(用PCR—RFLP方法，引物F2、R2扩增产物经酶切分析)：在拉咪呋定治疗中HBVD-NA聚合酶YMDD位点产生了变异，使得HBV DNA的原靶序列ATG发生了变化，引入的NdeI酶切位点缺失，从而产生119bp的变异株条带；在野毒株中引入的酶切位点存在并可以被酶消化切开，所以产生了99bb和20bp个的两个片段，20bp的小片段与引物带参杂在一起。
2.M552V变异：在确定了是YMDD变异后进一步分析是M552V、M5521变异，可以用NlaⅢ酶切，M552V变异，能够被此酶切开，DNA片段成为95bp和24bp的两个片段。
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3.528位点变异：除了YMDD变异以外，还存在DNA聚合酶B区528位点的变异，它是由528位亮氨 酸被蛋氨酸取代(1528M，用引物F3，R2扩增，产物是197bp，引入NLaⅢ酶切位点，如果是L552M变异，可以将其切开，形成176和22bp大小两个片段。
4.拉咪呋定治疗240例慢性乙型肝炎患者血清HBVDNA变异的情况：240例拉咪呋定治疗的慢性乙型肝炎患者52—78周，发生血清HBVDNA变异的共51例，其中M552V变异38例，M5521变异13例L528M变异27例；M522V变异同时有L528M变异的有26例，M5521变异同时有L528M变异的1例。在552位点单一基因变异的只有24例。
二、HBV DNA定量分析与YMDD变异的关系
慢性乙型肝炎病人服用拉咪呋定后HBADNA迅速下降到检测水平以下，当发生耐药基因突变时HBVDNA反跳240例患者中51例发生YMDD变异，患者血清HBV DNA定量分析与HBV DNA变异的比较
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见表1。
表1 HBV DNA定量分析与YMD变异的关系
TablThecorrelationbetweetheHBV DNA QuantitativePCRassayand'hemutationOfYMDD51例患者血清HBVDAN变异，DNA水平升高，但是70.58%患者(36/51)其DNA水平仍在1X105以下，高水平复制HBV DNA≥1X 108为13.72%(7/51)。HBVDNA测序法比较：用DNA序列分析检测验证RFLP方法是否可行，对三例标本进行了测序，2例检出YMDD变异，(其中1例为YVDD，伴有L528M变异，1例为YIDD变异)l例是野毒株(见表2)。
表2 3例患者核耷酸序列测定编码的HBVP基因区氨基酸序列
Table 2 HBV P gene range aminO acids sequence in 3 patients
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FRKTPMGVGLSPFLLAQFTS AECSVVRRAFPHCLAFSYM D DVVLGAKSVQHL
三、ALT水平变化与YMDD变异的关系
51例发生YHDD变异的患者在治疗52周-78周时34例ALT上水平明显高于无变异患者组(52周76.7+27.9L匕27.9+10.1，P：0.001；78周66.7+57.6L匕27，3+21.2，P：0.001)，治疗52周时，23例变异的患者中16例ALT升高，2例病人高于治疗前水平，伴血清胆红素升高，因而再次住院治疗。治疗78周时，28例变异患者中18例ALT升高，不论HBVDNA变异发生在什么时期，其血清ALT升高水平比较无明显差异。17例虽然发生YMDD变异，但未见血清ALT升高。
讨 论
拉咪呋定用于慢性乙型肝炎抗病毒治疗，日益受到病人的接受，但随着用药时间的延长，耐药变异株的出现也引起临床的重视。
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PCR限制性片段长度多态性分析方法测定HBV DNA YMDD变异是一种快速、经济。简单易行的方
法，国内外已有文献报道。
Cane等对8例慢性乙型肝炎患者给予拉咪呋定口服治疗，5/8例在治疗40-56周发生乙型肝炎突发，但是病毒滴度低于治疗前水平，分析HBV DNA聚合酶变异发现4/8M522V变异，4/8M5221变异，在4例M552V变异中均有L528M变异。作者认为M552V位于C区，L528M位于B区，M552V和L528M联合变异，说明了C区和B区在功能和结构上相互作用，HBV聚合酶在药物的作用下不断的选择调整，使病毒具有高复制水平。
Alleb等报道20例用拉咪呋定治疗导致乙型肝炎突发的患者，通过基因序列分析发现，所有患者都存在YWDD区变异，根据不同的变异形式分成两组，第一组18例患者均出现M552V变异和L528M变异，第二组2例出现M5521变异。
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在我国进行的拉咪呋定临床试验已经完成了三期观察，先后有一些临床报道其结果表明12.1(的患者治疗48周后出现YMDD变异)。张欣欣等报道19例拉咪呋定治疗的病人48周时HBV DAN变异，其中2例伴有ALT升高；1例治疗过程中HBV DNA从未阴转，ALT波动于正常值以下，且发生多聚酶其他部位的变异。另有报道拉咪呋定治疗2年的观察：52周和104周YMDD的变异率为13.7、39.7%。
发生变异后大部分HBV DNA水平升高或持续不降。ALT水平明显高于无变异组。在变异组中52周时有50%的患者发生ALT反跳，即高于治疗前水平，104周时有34.8%的患者发生ALT反跳。姚光弼等报道，治疗52周结束时发生YMDD变异的48例患者中，20例在治疗48周时HBV DNA转阳，仅6例(12.5%)高于治疗前水平。37例在治疗38周时ALT正常，11例升高，其中6例高于治疗前水平。我们在研究拉咪呋定治疗HBV感染的240例慢性乙型肝炎患者中发现，用药52-78周(1-1.5年)51(21，25%)例出现HBVDNA聚合酶变异，其中M552V变异38(74.5%)例，M5521变异13(25.49%)例，M552V和L528M同时出现变异26(50.89%)例，出现变异的时间为治疗12个月以上。发生变异的患者血清HBVDNA含量70.58%在105以下，仅一例为109。由于HBVDNA聚合酶变异发生在拉咪呋定作用位点，并且在治疗后出现，说明该变异与药物治疗有关，其结果是直接影响拉咪呋定的疗效，但发生变异以后病毒的复制能力较低，因此多数患者血清HBV DNA仍然在较低水平。用RFLP方法检测为1例野毒株，1例M552V变异伴有L528M变异，1例M5521为异的3例标本，经基因序列分析得到同样的结果，说明RLFP
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HBV长期在人群中感染和传播，受到宿主免疫系统和抗病毒药物的拮抗作用等因素的影响，可能产生HBVDNA序列的变异，逃避人体的免疫，继续复制、生长繁殖。HBV虽然不引起肝细胞的直接病变，但是肝脏损害是病毒持续启动复制和诱发机体免疫清除作用造成的，因此，对慢性乙型肝炎患者的综合治疗的同时，着重抗病毒治疗是重要的方案。拉咪呋定做为一类新的抗病毒药物，通过抑制HBV DNA聚合酶的活性，发挥其抗HBV的作用，具有一定的疗效，但是，在治疗中容易产生病毒变异。因此，在拉咪呋定治疗过程中，监视病人体内HBVDNA的变异情况，有助于了解病人机体内病毒复制的情况，以便观察疗效。, http://www.100md.com