肝脏胶原蛋白检测方法的进展与评析
刘成海 上海中医药大学肝研究所(上海，200032)
摘要 胶原含量之多少可以直接反映纤维化程度之轻重，胶原蛋白含量测定在肝纤维化机理与药理研究中极其重要，往往是结果分析的“终点指标”。综述肝脏胶原蛋白的生化与病理检测方法，结合个人实践体会，分析其各种不同方法的特点及适应范围。认为肝组织胶原蛋白以羟脯氨酸含量检测可靠，培养细胞总胶原分泌宜采用同位素掺人与胶原酶消化的方法，各型胶原分泌量可采用ELISA法，各型胶原沉积量可采用Westernblot法。肝组织与培养细胞胶原病理染色，主要用于胶原蛋白定性分析与表达位置检测，合理图像分析可半定量。
胶原是细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)的主要蛋白质成份，约占机体总蛋白的25%[1]。多细胞器官中的多数细胞均与ECM大分子密切联系，ECM不仅为细胞提供结构支架，而且也是重要的信号调节分子，能调控细胞的生长、代谢与分化。肝脏中胶原含量丰富，对肝细胞的分化、肝小叶结构与功能的维持等有重要影响。慢性肝炎、肝硬化等慢性肝病均存在以胶原为主的ECM增生沉积的病理变化，即肝纤维化。
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研究表明[2]，肝星状细胞(hePatistellatecell，HSC)在肝损伤后，活化为“肌成纤维样细胞(Myofibroblastlike·
cell，MPB)”，大量合成与分泌间质性胶原等ECM，是肝纤维化的细胞学基础。肝纤维化时，胶原等ECM成
份的数量与分布位置均发生改变，表现为数量增加3—5倍，内皮不间隙(狄氏间隙)胞外基质成分从正常的
低密度基底膜样基质问以纤维胶原为主的间质性胺原转变。这种胶原的数量与分布的改变，明显影响肝脏
的结构与功能。因此，准确、合理分析肝脏胶原的含量变化，在肝纤维化机理研究与抗肝纤维化药物评价中
均有重要意义。但是，胶原类型较多，结构稳定，多难溶于水，一般化学方法不易区分，迄今国内外尚未见稳
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定的试剂盒。本文就常用的肝脏胶原分析方法简要归纳，并就各自特点与优缺点评述于下。
一、肝脏胶原的种类与结构特征。
迄今已确定了19种不同基因的胶原类型[1]，以发现先后的时间顺序、冠以罗马字母命名。.
胶原的分子结构特征是由3条左手螺旋。肽链续合成右手旋转的超三螺旋。胶原既可由相同的3条。
链组成，如Ⅲ型胶原由3条(。(Ⅲ)链组成[(1(Ⅲ)]，也可由不同的。链组成，如工型胶原由2条[。l(1)21条。2(1)]链组成[。l(1)2。2(1))。尽管不同类型胶原的(链是特定基因的表达产物，但其一级结构均为“Gly—X
—Y”(X多为Pro，Y多为HyP)。“羟化”是胶原蛋白转录后的修饰特点，通过脯氨酸或赖氨酸羟化酶使脯氨
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酸或赖氨酸残基加上羟基。羟脯氨酸羟基通过分子间氢键起稳定胶原螺旋结构的作用；羟赖氨酸羟基则提
供糖类分子的附着位点，并在胶原分泌至胞外后，通过赖氨酸氧化酶在羟赖氨酸、赖氨酸之间醛基缩合，发挥
稳定胶原分子间交连的作用。间质性胶原成纤维索状，具有弹性与韧性，多起维持组织结构作用；基底膜胶
原多为筛状，具有过滤功能。
肝脏中主要有5类胶原[3]，间质性胶原包括I，Ⅲ，V，Ⅵ等，基底膜胶原有IV型胶原。正常人肝脏胶
原约占肝重的2%，肝硬化时上升至8%—10%。正常人肝脏胶原中工，Ⅲ，Ⅳ，V，Ⅵ型胶原含量分别为
42.5%、39.5%、6.9%、10.6%与0.6%，肝硬化时分别为56.5%、28.0%、5.5%、9.6%与0.5%，以工型胶
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原显著增加为特征。位置分布上，I、Ⅲ型等间质胶原多分布于汇管区与大血管区，Ⅳ型胶原主要分布于肝
窦狄氏间隙。肝脏慢性损伤时，I型胶原显著增多，使正常肝内I/Ⅲ型胶原比例倒置，取代狄氏间隙的Ⅳ胶
原，导致肝窦毛细血管化与肝纤维化。
二、肝组织羟脯氨酸含量测定法。
羟脯氨酸是肝脏胶原蛋白所特有的氨基酸，因此测定羟脯氨酸含量，可明确胶原总体水平。该方法是分
析组织胶原水平的标准方法，有水解、衍生与检测等3个过程。水解，即组织蛋白质样品中加入浓盐酸
(6mol/L)，真空状态下高温(105~(2左右)反应18h—24h，将胶原的一级结构破坏，使蛋白质分解为氨基酸，而
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后将水解液烘干，蒸发掉盐酸。水解的完全与否，对羟脯氨酸测定结果影响很大。但该方法较为烦琐，且酸
雾对烘箱等设备有腐蚀影响。1982年Stein提出气相水解法[4)，而后Waters公司推出了商品化仪器一气相
水解工作台，其基本过程是将100--500pM的蛋白质或多肽样品置于水解指管中冷冻抽干，在水解反应器中
加人200~1浓盐酸与2%苯酚，然后将反应指管转移到反应器中抽真空110~C反应22h。该改进方法无需烘
干，并可减轻腐蚀与提高工作效率。
衍生，即水解液与同其他化合物反应生产有颜色的化合物。其原理基于酸性水解液中4一羟脯氨酸经
氯铵T氧化，而后与欧氏溶液[25%(w/v)对二甲基氨基甲苯、27.3%(V/v)高氯酸的异丙醇溶液]反应生成
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吡咯样物质。通过HPLC或分光光度计比色，可检测其水解液中羟脯氨酸的含量。检测主要是化学比色
法，除分光光度计外，无需其他特色设备与技术，简单易行。50年代建立，后在80年代经James改良l引，更
为简便可靠，是常用的方法。羟脯氨酸与反应产物吡咯正相关，通过测定反应液中吡咯在最大吸收峰
(max560)处的吸光度(OD)值，并通过羟脯氨酸标准品建立外标准，即羟脯氨酸与最终反应产物吸光度值的
直线回归方程，可计算出样品的卜羟脯氨酸含量。外标准中羟脯氨酸与吡咯吸光度呈良好的线性关系，显
著正相关，我们多次实验均得到很好的重复性结果，图1。
James要求羟脯氨酸标准品新鲜配置，但我们发现50%异丙醇溶解的标准品溶液4~C放置过夜后溶解
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性与灵敏性更好，而且相当稳定，超过半年仍可很好的重复使用。我们采用化学比色法检测正常肝脏组织羟
脯氨酸含量大致为203±60t~g肝组织，二甲基亚硝胺纤维化大鼠中含量为370±66pg肝组织16』，四氯化碳纤
维化大鼠中含量为241土48pg肝组织[刊。但是化学比色法灵敏度较低，只可检测到lug(7.6nm01)以上的
4一羟脯氨酸，多适用于胶原丰富的肝组织大样品，不宜于细胞培养小样品。此外，不能区分测定羟脯氨酸的
同源异构体一3一羟脯氨酸。而后发展改进的高效液相色谱法则弥补了这些缺点[8]，可较好区分测定3一羟
脯氨酸与4口羟脯氨酸，并将测量水平提高到pmol级。但是其需要特殊的HPLC设备与技术。此外，虽然
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两种脯氨酸含量测定方法，无需同位素标记，可方便较好的检测肝组织胶原总体水平，但是均需水解反应，其
强酸条件较为苛刻，时间较长；也无法区别不同类型的胶原含量。
三、同位素标记脯氨酸掺人与胶原酶消化法测定胶原生成率。
胶原蛋白的翻译需要大量脯氨酸，部分脯氨酸成为前胶原肽键的组成成分，并经羟化修饰为羟脯氨酸。
因此，通过脯氨酸掺人可了解胶原生成情况。然后脯氨酸广泛存在于许多蛋白质中；非为胶原蛋白所特有，仅仅脯氨酸掺人并不能代表细胞的胶原生成[9]。纯化的胶原酶可特异性切割胶原蛋白(Pro—X十一Gly—
pro—，箭头所指为酶切部位)，使之降解为小片断。因此，可首先通过同位素标记的脯氨酸掺入，获得新生成
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的脯氨酸标记的总蛋白量(同位素掺人量)；而后通过胶原酶的特异降解，区分胶原与非胶原蛋白。通过计算
胶原酶敏感蛋白即胶原蛋白在总蛋白的百分比，即可测知细胞内的胶原合成率与细胞外胶原分泌率。大致
步骤与方法如下。
1.[’刚Pro掺人。前胶原。肽链在胞内翻译后，有一系列翻译后修饰，其中之一是在脯氨酸--4--羟化
酶(prom—4—hvdroxylase，P4H)催化下，在Pro残基的4位C原子上进行羟化。该羟化酶有2个Q亚基与
2个p基组成，其活性需Fe2’，(X--'-酮戊二酸与抗坏血酸等参与。常规的掺人反应为：含1—5%胎牛血清的
DMEM，5—20rtCi[2，3—’刚一Pro，50rtg/ml的抗坏血酸，温育细胞24h。其中抗坏血酸有抗氧化作用，保持
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Fe2+在还原状态；’H较’‘S半衰期长，处理容易，故多采用。此外，为防止非同位素标记Pro的竞争掺人，提
高[3刚Pro掺人效率，细胞培养液采用缺乏Pro的DMEM。
2.胶原酶消化与测定。掺人后，所收集的样本中无论培养上清还是细胞层蛋白，均包括未掺人细胞的
游离[’刚Pro与[’H)Pro掺人的总蛋白，而该掺人总蛋白包括非胶原蛋白与胶原蛋白。因此，去除游离[3h]刚
Pro影响与区分非胶原蛋白，是测定胶原生成率的关键。非胶原蛋白可通过胶原酶消化而区分，而去除游离
I’刚Pro大致有以下2种方法。
1)透析后消化法；透析去除游离[3H]Pro，而后将样本进行消化[5](图2)。透析一般是将样本置于透析
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袋，经25mM TriS—HClpH7.4与50mM乙酰马来醛透析液，4~C下透析3--4天，每天更换透析波，直至透
析液中放射性降至本底水平。乙酰马来醛为蛋白酶抑制剂，可防止样本蛋白的非特异降解。透析后，蛋白样
本等分为3：1份不消化，直接测定总蛋白含量；1份加入胶原酶、CaCl2(胶原酶激活剂)与乙酰马来醛等，37~C下反应2h，以裂解胶原蛋白；1份为空白对照，消化反应中时不加胶原酶。后2份经三氯醋酸沉淀与离
心，分离未被酶消化的非胶原蛋白；离心上清即为胶原蛋白。分别计数总蛋白(~pmt)、胶原蛋白(cpm，)与空
白对照(cpmb)的放射性，即可算出胶原生成率(公式1)。我们采用此法测定传一代培养肝星状细胞的胶原
生成率，分别为细胞内0.8%—1.2%、细胞外2.5%—4%。而总蛋白中胶原蛋白的[’H]Pro掺入量分别为
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细胞内7.9%、细胞外12.8%左右门，8J、该方法无需对消化后沉淀的非胶原蛋白溶解与测定，但是消化前的透析较烦琐，时间较长，重复性欠佳。 ·
胶原生成率：
J.I，只＼Upmt—cpmc/T kcpmC—cpiUb/十i
2)直接消化法；不透析，将样本等份为2：一份不加胶原酶，为空白对照；另一份加胶原酶消化。而后经
三氯醋酸沉淀，离心，分别取上清与溶解的沉淀物，测定其dpm。胶原绝对含量以空白管与胶原酶消化管沉
淀物的数值计算。胶原的生成率以胶原酶消化管的上清与沉淀物放射活性计算，公式2。该方法无需透析，简易方便，费时较短，但是需要溶解沉淀的非胶原蛋白，一般溶剂难以溶解；可采用Packard公司的
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Soluene350溶剂。两种方法均不受接种细胞数量的影响，可较好的反映细胞胶原生成情况，但不适于整体动
物体内与临床病人的胶原生成量分析。
胶原含量二空白管沉淀物dDm—胶原酶管沉淀物dpm。(公式2—1)
胶原生成率：(公式2—2)
四、专一抗体结合、免疫反应法测定不同类型胶原含量。
1.免疫印迹法(Westernblot)。于培养细胞而言，蛋白可分为上清蛋白、细胞蛋白(包括胞膜蛋白、胞质
蛋白与核蛋白)、基质蛋白等多种，图4。因此根据蛋白样品的来源不同，可以分别分析胶原分泌、细胞内胶
原合成或细胞外胶原沉积量等。即若采用培养上清，则为分泌量；若采用细胞粗提物，则为细胞内生成量；若
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采用培养器tm k沉积蛋白，则为胶原沉积量。蛋白样品制备后，进行SDS—PAGE凝胶电泳，使蛋白质因分
子量大小而区分；将凝胶转移到硝酸纤维素等膜上，脱脂奶粉或牛血清蛋白封闭后，经特异性胶原抗体(如1
型胶原抗体)孵育结合，洗涤未结合的抗体，而后与偶联HRP或AKP酶的抗抗体结合，经化学显色，X片曝
光。通过分子量位置可确定胶片上胶原蛋白表达条带。此法定性与定量相结合，特异性高，灵敏性好，结果
直观明了。且可通过标准分子量蛋白比较定位，区分胶原蛋白的不同亚型。蛋白表达量既可肉眼直观判断，也可计算机图像分析扫描，由于图片为黑白方式，条带较规则，无需二值分割，采用图像分析软件即可较好分
析蛋白表达量。并且可设立严格的内参照，排除样本上样量与转移效率等因素的影响，即洗脱该膜胶原抗体
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后，用“看家蛋白”抗体(如p—actin，p—tubulin等)在同一张膜上连续免疫结合呈色。图5为用该法检测原
代培养肝星状细胞的细胞内I’型胶原蛋白表达。但westernblot方法需要一定的设备与技术。
2.酶联免疫测定法(ELISA)。此法原理亦为免疫结合。将目的胶原样本作为抗原包被于96孔板上，与抗体结合，再与HRP或AKP酶偶联的抗抗体结合，经化学呈色反应，酶标仪读取吸光度值。由于抗体一
抗原抗体复合物一酶一底物最色之间有正相关关系，故检测显色底物的吸光度值，即可测知抗原(胶原)的相
对含量110J。通过一定浓度梯度稀释胶原标准品建立外标准，计算出胶原含量与最终显色产物之间的直线回
归方程，以此方程及样本反应的吸光度值，即可计算出样本胶原的浓度。该方法适合于体外细胞实验，同样
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具有灵敏、特异的优点，可以分析细胞上清或细胞内各型胶原的分泌量或合成量，并且经细胞总蛋白或DNA
浓度效正，可以排除细胞数量的影响[1刨、缺点是每一步都需洗涤，过程较长；不适于组织标本；样本的包被主
要是物理结合，不同材料间重复性较差。
五、病理胶原染色、彩色图像分析法半定量原位分析总胶原与不同类型胶原的含量。
既往病理组织化学与免疫组织化学观察多应用于定性研究，随着形态定量方法的发展和计算机技术的
普及，图像分析仪器的广泛应用，生物形态学向定量研究发展。图像分析方法大致为：首先将显微镜下的组
织染色图像通过摄像头与图像采集卡录入计算机。其次是在计算上选取所要分析的目标，因免疫组化染色
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蛋白呈一定颜色，且因背景染色或衬染，周围组织有不同颜色着色，因此需要设定色彩的上下限阈值，二值分
割，将目标蛋白质“伪彩色”，使之为计算机识别。而后自动计算所识别对象的面积、灰度等参数值，从而半定
量组织目标蛋白的含量。该方法简便易行、自动化程度高，非常适合于临床肝组织等难以进行生化分析的小
样组织标本，随胶原染色方法的不同，可以分别分析总胶原或各种不同类型的胶原含量。目前用于图像分析
的常见胶原病理染色方法有；1)丽春红总胶原染色，常规显微镜镜头下观察总胶原的变化；2)天狼猩红染色，偏振光下分别观察I、Ⅲ型胶原的变化，一般I型胶原呈黄红色，Ⅲ型胶原呈绿色；3)通过各种特异胶原抗体 进行肝脏组织免疫组化染色，分别观察各种不同型别胶原的变化。
, 百拇医药 这三种方法均存在随机取样时的抽样误差与二值分割时的背景干扰。抽样误差包括组织取材部位，图
像采集视野等[：3)。而图像二值分割时，目标染色蛋白区域的选取往往较大程度上受组织片背景的亮度强弱
与颜色深浅，组织片本身染色的深浅，及其设定选取颜色范围的上限与下限等等多种因素影响，所测光密度
值也往往随之有较大范围波动。此外需要指出的是，天狼猩红染色+偏振光观察以区分I、Ⅲ型胶原的方法
目前有许多争议。Junqueira于1978年采用该方法[14]，发现I型胶原是黄色、桔黄或红色，Ⅲ型胶原呈绿色。
Nic。letti证实了该发现[，5l，我国也有学者采用该方法以鉴别I、Ⅲ型胶原[：‘，，刊。但是Junqueira在其后的文
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章强调了该方法对于胶原染色特异性[：刨，没再提及鉴别胶原性质；而Pierard等发现该方法主要反应总胶原
含量，而不能区分胶原型别[，’，：o)。然而，无论何种病理染色方法，主要在于反应胶原的分布位置与性质，合
理采用图像分析可进行半定量。可靠的定量分析仍需采用生化方法。 · ，总之，胶原含量多少可以直接反映纤维化程度之轻重，其蛋白含量测定在肝纤维化研究中极其重要，往
往是“终点指标”(endPoint)。在实际应用中，应根据具体情况与目标，选择合适的方法。
(致谢：承蒙上海中医药大学肝病研究所徐列明研究员与顾宏图助理研究员提供部分资料与宝贵意见，特此致谢!) .
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胶原是细胞外基质(Extracellularmatrix，ECM)的主要蛋白质成份，约占机体总蛋白的25%[1]。多细胞器官中的多数细胞均与ECM大分子密切联系，ECM不仅为细胞提供结构支架，而且也是重要的信号调节分子，能调控细胞的生长、代谢与分化。肝脏中胶原含量丰富，对肝细胞的分化、肝小叶结构与功能的维持等有重要影响。慢性肝炎、肝硬化等慢性肝病均存在以胶原为主的ECM增生沉积的病理变化，即肝纤维化。
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研究表明[2]，肝星状细胞(hePatistellatecell，HSC)在肝损伤后，活化为“肌成纤维样细胞(Myofibroblastlike·
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份的数量与分布位置均发生改变，表现为数量增加3—5倍，内皮不间隙(狄氏间隙)胞外基质成分从正常的
低密度基底膜样基质问以纤维胶原为主的间质性胺原转变。这种胶原的数量与分布的改变，明显影响肝脏
的结构与功能。因此，准确、合理分析肝脏胶原的含量变化，在肝纤维化机理研究与抗肝纤维化药物评价中
均有重要意义。但是，胶原类型较多，结构稳定，多难溶于水，一般化学方法不易区分，迄今国内外尚未见稳
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定的试剂盒。本文就常用的肝脏胶原分析方法简要归纳，并就各自特点与优缺点评述于下。
一、肝脏胶原的种类与结构特征。
迄今已确定了19种不同基因的胶原类型[1]，以发现先后的时间顺序、冠以罗马字母命名。.
胶原的分子结构特征是由3条左手螺旋。肽链续合成右手旋转的超三螺旋。胶原既可由相同的3条。
链组成，如Ⅲ型胶原由3条(。(Ⅲ)链组成[(1(Ⅲ)]，也可由不同的。链组成，如工型胶原由2条[。l(1)21条。2(1)]链组成[。l(1)2。2(1))。尽管不同类型胶原的(链是特定基因的表达产物，但其一级结构均为“Gly—X
—Y”(X多为Pro，Y多为HyP)。“羟化”是胶原蛋白转录后的修饰特点，通过脯氨酸或赖氨酸羟化酶使脯氨
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酸或赖氨酸残基加上羟基。羟脯氨酸羟基通过分子间氢键起稳定胶原螺旋结构的作用；羟赖氨酸羟基则提
供糖类分子的附着位点，并在胶原分泌至胞外后，通过赖氨酸氧化酶在羟赖氨酸、赖氨酸之间醛基缩合，发挥
稳定胶原分子间交连的作用。间质性胶原成纤维索状，具有弹性与韧性，多起维持组织结构作用；基底膜胶
原多为筛状，具有过滤功能。
肝脏中主要有5类胶原[3]，间质性胶原包括I，Ⅲ，V，Ⅵ等，基底膜胶原有IV型胶原。正常人肝脏胶
原约占肝重的2%，肝硬化时上升至8%—10%。正常人肝脏胶原中工，Ⅲ，Ⅳ，V，Ⅵ型胶原含量分别为
42.5%、39.5%、6.9%、10.6%与0.6%，肝硬化时分别为56.5%、28.0%、5.5%、9.6%与0.5%，以工型胶
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原显著增加为特征。位置分布上，I、Ⅲ型等间质胶原多分布于汇管区与大血管区，Ⅳ型胶原主要分布于肝
窦狄氏间隙。肝脏慢性损伤时，I型胶原显著增多，使正常肝内I/Ⅲ型胶原比例倒置，取代狄氏间隙的Ⅳ胶
原，导致肝窦毛细血管化与肝纤维化。
二、肝组织羟脯氨酸含量测定法。
羟脯氨酸是肝脏胶原蛋白所特有的氨基酸，因此测定羟脯氨酸含量，可明确胶原总体水平。该方法是分
析组织胶原水平的标准方法，有水解、衍生与检测等3个过程。水解，即组织蛋白质样品中加入浓盐酸
(6mol/L)，真空状态下高温(105~(2左右)反应18h—24h，将胶原的一级结构破坏，使蛋白质分解为氨基酸，而
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后将水解液烘干，蒸发掉盐酸。水解的完全与否，对羟脯氨酸测定结果影响很大。但该方法较为烦琐，且酸
雾对烘箱等设备有腐蚀影响。1982年Stein提出气相水解法[4)，而后Waters公司推出了商品化仪器一气相
水解工作台，其基本过程是将100--500pM的蛋白质或多肽样品置于水解指管中冷冻抽干，在水解反应器中
加人200~1浓盐酸与2%苯酚，然后将反应指管转移到反应器中抽真空110~C反应22h。该改进方法无需烘
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衍生，即水解液与同其他化合物反应生产有颜色的化合物。其原理基于酸性水解液中4一羟脯氨酸经
氯铵T氧化，而后与欧氏溶液[25%(w/v)对二甲基氨基甲苯、27.3%(V/v)高氯酸的异丙醇溶液]反应生成
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吡咯样物质。通过HPLC或分光光度计比色，可检测其水解液中羟脯氨酸的含量。检测主要是化学比色
法，除分光光度计外，无需其他特色设备与技术，简单易行。50年代建立，后在80年代经James改良l引，更
为简便可靠，是常用的方法。羟脯氨酸与反应产物吡咯正相关，通过测定反应液中吡咯在最大吸收峰
(max560)处的吸光度(OD)值，并通过羟脯氨酸标准品建立外标准，即羟脯氨酸与最终反应产物吸光度值的
直线回归方程，可计算出样品的卜羟脯氨酸含量。外标准中羟脯氨酸与吡咯吸光度呈良好的线性关系，显
著正相关，我们多次实验均得到很好的重复性结果，图1。
James要求羟脯氨酸标准品新鲜配置，但我们发现50%异丙醇溶解的标准品溶液4~C放置过夜后溶解
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性与灵敏性更好，而且相当稳定，超过半年仍可很好的重复使用。我们采用化学比色法检测正常肝脏组织羟
脯氨酸含量大致为203±60t~g肝组织，二甲基亚硝胺纤维化大鼠中含量为370±66pg肝组织16』，四氯化碳纤
维化大鼠中含量为241土48pg肝组织[刊。但是化学比色法灵敏度较低，只可检测到lug(7.6nm01)以上的
4一羟脯氨酸，多适用于胶原丰富的肝组织大样品，不宜于细胞培养小样品。此外，不能区分测定羟脯氨酸的
同源异构体一3一羟脯氨酸。而后发展改进的高效液相色谱法则弥补了这些缺点[8]，可较好区分测定3一羟
脯氨酸与4口羟脯氨酸，并将测量水平提高到pmol级。但是其需要特殊的HPLC设备与技术。此外，虽然
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两种脯氨酸含量测定方法，无需同位素标记，可方便较好的检测肝组织胶原总体水平，但是均需水解反应，其
强酸条件较为苛刻，时间较长；也无法区别不同类型的胶原含量。
三、同位素标记脯氨酸掺人与胶原酶消化法测定胶原生成率。
胶原蛋白的翻译需要大量脯氨酸，部分脯氨酸成为前胶原肽键的组成成分，并经羟化修饰为羟脯氨酸。
因此，通过脯氨酸掺人可了解胶原生成情况。然后脯氨酸广泛存在于许多蛋白质中；非为胶原蛋白所特有，仅仅脯氨酸掺人并不能代表细胞的胶原生成[9]。纯化的胶原酶可特异性切割胶原蛋白(Pro—X十一Gly—
pro—，箭头所指为酶切部位)，使之降解为小片断。因此，可首先通过同位素标记的脯氨酸掺入，获得新生成
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的脯氨酸标记的总蛋白量(同位素掺人量)；而后通过胶原酶的特异降解，区分胶原与非胶原蛋白。通过计算
胶原酶敏感蛋白即胶原蛋白在总蛋白的百分比，即可测知细胞内的胶原合成率与细胞外胶原分泌率。大致
步骤与方法如下。
1.[’刚Pro掺人。前胶原。肽链在胞内翻译后，有一系列翻译后修饰，其中之一是在脯氨酸--4--羟化
酶(prom—4—hvdroxylase，P4H)催化下，在Pro残基的4位C原子上进行羟化。该羟化酶有2个Q亚基与
2个p基组成，其活性需Fe2’，(X--'-酮戊二酸与抗坏血酸等参与。常规的掺人反应为：含1—5%胎牛血清的
DMEM，5—20rtCi[2，3—’刚一Pro，50rtg/ml的抗坏血酸，温育细胞24h。其中抗坏血酸有抗氧化作用，保持
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Fe2+在还原状态；’H较’‘S半衰期长，处理容易，故多采用。此外，为防止非同位素标记Pro的竞争掺人，提
高[3刚Pro掺人效率，细胞培养液采用缺乏Pro的DMEM。
2.胶原酶消化与测定。掺人后，所收集的样本中无论培养上清还是细胞层蛋白，均包括未掺人细胞的
游离[’刚Pro与[’H)Pro掺人的总蛋白，而该掺人总蛋白包括非胶原蛋白与胶原蛋白。因此，去除游离[3h]刚
Pro影响与区分非胶原蛋白，是测定胶原生成率的关键。非胶原蛋白可通过胶原酶消化而区分，而去除游离
I’刚Pro大致有以下2种方法。
1)透析后消化法；透析去除游离[3H]Pro，而后将样本进行消化[5](图2)。透析一般是将样本置于透析
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袋，经25mM TriS—HClpH7.4与50mM乙酰马来醛透析液，4~C下透析3--4天，每天更换透析波，直至透
析液中放射性降至本底水平。乙酰马来醛为蛋白酶抑制剂，可防止样本蛋白的非特异降解。透析后，蛋白样
本等分为3：1份不消化，直接测定总蛋白含量；1份加入胶原酶、CaCl2(胶原酶激活剂)与乙酰马来醛等，37~C下反应2h，以裂解胶原蛋白；1份为空白对照，消化反应中时不加胶原酶。后2份经三氯醋酸沉淀与离
心，分离未被酶消化的非胶原蛋白；离心上清即为胶原蛋白。分别计数总蛋白(~pmt)、胶原蛋白(cpm，)与空
白对照(cpmb)的放射性，即可算出胶原生成率(公式1)。我们采用此法测定传一代培养肝星状细胞的胶原
生成率，分别为细胞内0.8%—1.2%、细胞外2.5%—4%。而总蛋白中胶原蛋白的[’H]Pro掺入量分别为
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细胞内7.9%、细胞外12.8%左右门，8J、该方法无需对消化后沉淀的非胶原蛋白溶解与测定，但是消化前的透析较烦琐，时间较长，重复性欠佳。 ·
胶原生成率：
J.I，只＼Upmt—cpmc/T kcpmC—cpiUb/十i
2)直接消化法；不透析，将样本等份为2：一份不加胶原酶，为空白对照；另一份加胶原酶消化。而后经
三氯醋酸沉淀，离心，分别取上清与溶解的沉淀物，测定其dpm。胶原绝对含量以空白管与胶原酶消化管沉
淀物的数值计算。胶原的生成率以胶原酶消化管的上清与沉淀物放射活性计算，公式2。该方法无需透析，简易方便，费时较短，但是需要溶解沉淀的非胶原蛋白，一般溶剂难以溶解；可采用Packard公司的
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Soluene350溶剂。两种方法均不受接种细胞数量的影响，可较好的反映细胞胶原生成情况，但不适于整体动
物体内与临床病人的胶原生成量分析。
胶原含量二空白管沉淀物dDm—胶原酶管沉淀物dpm。(公式2—1)
胶原生成率：(公式2—2)
四、专一抗体结合、免疫反应法测定不同类型胶原含量。
1.免疫印迹法(Westernblot)。于培养细胞而言，蛋白可分为上清蛋白、细胞蛋白(包括胞膜蛋白、胞质
蛋白与核蛋白)、基质蛋白等多种，图4。因此根据蛋白样品的来源不同，可以分别分析胶原分泌、细胞内胶
原合成或细胞外胶原沉积量等。即若采用培养上清，则为分泌量；若采用细胞粗提物，则为细胞内生成量；若
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采用培养器tm k沉积蛋白，则为胶原沉积量。蛋白样品制备后，进行SDS—PAGE凝胶电泳，使蛋白质因分
子量大小而区分；将凝胶转移到硝酸纤维素等膜上，脱脂奶粉或牛血清蛋白封闭后，经特异性胶原抗体(如1
型胶原抗体)孵育结合，洗涤未结合的抗体，而后与偶联HRP或AKP酶的抗抗体结合，经化学显色，X片曝
光。通过分子量位置可确定胶片上胶原蛋白表达条带。此法定性与定量相结合，特异性高，灵敏性好，结果
直观明了。且可通过标准分子量蛋白比较定位，区分胶原蛋白的不同亚型。蛋白表达量既可肉眼直观判断，也可计算机图像分析扫描，由于图片为黑白方式，条带较规则，无需二值分割，采用图像分析软件即可较好分
析蛋白表达量。并且可设立严格的内参照，排除样本上样量与转移效率等因素的影响，即洗脱该膜胶原抗体
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后，用“看家蛋白”抗体(如p—actin，p—tubulin等)在同一张膜上连续免疫结合呈色。图5为用该法检测原
代培养肝星状细胞的细胞内I’型胶原蛋白表达。但westernblot方法需要一定的设备与技术。
2.酶联免疫测定法(ELISA)。此法原理亦为免疫结合。将目的胶原样本作为抗原包被于96孔板上，与抗体结合，再与HRP或AKP酶偶联的抗抗体结合，经化学呈色反应，酶标仪读取吸光度值。由于抗体一
抗原抗体复合物一酶一底物最色之间有正相关关系，故检测显色底物的吸光度值，即可测知抗原(胶原)的相
对含量110J。通过一定浓度梯度稀释胶原标准品建立外标准，计算出胶原含量与最终显色产物之间的直线回
归方程，以此方程及样本反应的吸光度值，即可计算出样本胶原的浓度。该方法适合于体外细胞实验，同样
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具有灵敏、特异的优点，可以分析细胞上清或细胞内各型胶原的分泌量或合成量，并且经细胞总蛋白或DNA
浓度效正，可以排除细胞数量的影响[1刨、缺点是每一步都需洗涤，过程较长；不适于组织标本；样本的包被主
要是物理结合，不同材料间重复性较差。
五、病理胶原染色、彩色图像分析法半定量原位分析总胶原与不同类型胶原的含量。
既往病理组织化学与免疫组织化学观察多应用于定性研究，随着形态定量方法的发展和计算机技术的
普及，图像分析仪器的广泛应用，生物形态学向定量研究发展。图像分析方法大致为：首先将显微镜下的组
织染色图像通过摄像头与图像采集卡录入计算机。其次是在计算上选取所要分析的目标，因免疫组化染色
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蛋白呈一定颜色，且因背景染色或衬染，周围组织有不同颜色着色，因此需要设定色彩的上下限阈值，二值分
割，将目标蛋白质“伪彩色”，使之为计算机识别。而后自动计算所识别对象的面积、灰度等参数值，从而半定
量组织目标蛋白的含量。该方法简便易行、自动化程度高，非常适合于临床肝组织等难以进行生化分析的小
样组织标本，随胶原染色方法的不同，可以分别分析总胶原或各种不同类型的胶原含量。目前用于图像分析
的常见胶原病理染色方法有；1)丽春红总胶原染色，常规显微镜镜头下观察总胶原的变化；2)天狼猩红染色，偏振光下分别观察I、Ⅲ型胶原的变化，一般I型胶原呈黄红色，Ⅲ型胶原呈绿色；3)通过各种特异胶原抗体 进行肝脏组织免疫组化染色，分别观察各种不同型别胶原的变化。
, 百拇医药 这三种方法均存在随机取样时的抽样误差与二值分割时的背景干扰。抽样误差包括组织取材部位，图
像采集视野等[：3)。而图像二值分割时，目标染色蛋白区域的选取往往较大程度上受组织片背景的亮度强弱
与颜色深浅，组织片本身染色的深浅，及其设定选取颜色范围的上限与下限等等多种因素影响，所测光密度
值也往往随之有较大范围波动。此外需要指出的是，天狼猩红染色+偏振光观察以区分I、Ⅲ型胶原的方法
目前有许多争议。Junqueira于1978年采用该方法[14]，发现I型胶原是黄色、桔黄或红色，Ⅲ型胶原呈绿色。
Nic。letti证实了该发现[，5l，我国也有学者采用该方法以鉴别I、Ⅲ型胶原[：‘，，刊。但是Junqueira在其后的文
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章强调了该方法对于胶原染色特异性[：刨，没再提及鉴别胶原性质；而Pierard等发现该方法主要反应总胶原
含量，而不能区分胶原型别[，’，：o)。然而，无论何种病理染色方法，主要在于反应胶原的分布位置与性质，合
理采用图像分析可进行半定量。可靠的定量分析仍需采用生化方法。 · ，总之，胶原含量多少可以直接反映纤维化程度之轻重，其蛋白含量测定在肝纤维化研究中极其重要，往
往是“终点指标”(endPoint)。在实际应用中，应根据具体情况与目标，选择合适的方法。
(致谢：承蒙上海中医药大学肝病研究所徐列明研究员与顾宏图助理研究员提供部分资料与宝贵意见，特此致谢!) .
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