维护血管内皮功能对心脑血管疾病的重要意义——系列研究之九 通心络对急性缺血性卒中微小循环障碍的影响
蔡定芳 教授 现任中国中西医结合学会理事、《中国中西医结合杂志》编委、上海市中西医结合神经科专业委员会委员、中国中医药学会博士学术委员会副主任委员；曾于九十年代作为访问学者和特别研究员，分别留学日本国德岛大学医学部和富山医科药科大学，从事神经科学的临床与实验研究；现为复旦大学中西医结合研究所副所长、附属中山医院中医科主任博士生导师。
主要成就：以第一作者在国内外医学期刊发表学术论文80余篇合著9部。曾承担中日合作攻关、国家自然科学基金、卫生部、教育部、国家中医药管理局等多项研究课题；获国家教委和上海市科学技术进步二、三等奖项和全国中青年医学科技之星等称号。指导硕士研究生13名、博士研究生6名。
, 百拇医药 最近研究表明，急性缺血性脑卒中脑微小循环障碍是导致半影区低灌注或无灌注现象的重要病理生理过程1。为探讨中医络病理论与急性缺血性卒中脑微小循环障碍的内在联系，本研究观察通心络对大脑中动脉线栓法middke cerebrak artery occkusionMCAO大鼠神经功能缺损、梗死体积、血脑屏障及金属基质蛋白酶基因表达的影响，现报告如下。
材料与方法
1.实验动物：雄性12周龄Sprague-Dawkey大鼠，体重(250～280)g，由中国科学院上海分院实验动物中心提供合格证书：医动字-1996-02-22-6号。饲养于复旦大学附属中山医院清洁级实验动物中心，动物自由进食、进水。动物房12h光暗交替，温度22℃。动物适应环境1周后开始实验。依据分层随机原则，按照随机数字表确定随机数字，将动物分为假手术组、模型组和通心络组，每组各20只。
, 百拇医药 通心络组动物在MCAO后即刻腹腔给药，以后每隔12 h给药一次，直至实验结束。模型组与假手术组均以等体积蒸馏水替代通心络。
2.主要试剂及仪器：SD-78双极射频电凝器(上海医疗器械高技术公司产品)；PCR仪购自PE公司；电泳仪及水平电泳槽购自BioRad公司；FC 4D型超薄切片机为美国莱卡公司产品；CM-120透射电镜(Phikkp公司)甲酰胺、EB购自中国医药集团上海化学试剂公司；RNA PCR Kit购自Promega 公司；Trizok Reagent、Taq DNA聚合酶等购自上海华美生物工程公司；DNA Ladder购自北京国华公司；MMP-9与β-actin引物购自上海博亚生物技术有限公司。
3.大鼠MCAO再灌注模型的建立：动物术前12 h禁食不禁水。参照Zea-Longa2大鼠大脑MCAO模型，具体操作方法如下：1插线的制备：4-0单股尼龙线，每段长3.0 cm，在显微镜下将尼龙线端烫成圆头，而后浸泡于生理盐水中备用；2MCAO模型制作：所有大鼠均选择左侧MCA区作为梗塞侧，10%水合氯醛0.36 g/kg腹腔麻醉成功后，正中切开颈部皮肤，暴露颈外动脉和颈总动脉，分离颈外动脉和颈内动脉主干及分支。用双极电凝器电凝并剪断颈外动脉分出的枕动脉和甲状腺上动脉，在舌动脉和颌动脉分叉处结扎颈外动脉，用动脉夹夹闭颈外动脉和颈内动脉的分叉处；然后在颈外动脉远端结扎处附近剪一小口，插入尼龙线并疏松结扎。剪断颈外动脉，放开动脉夹，拉直颈外动脉并使之与颈内动脉成一直线。缓慢推动尼龙线进入颈内动脉，直至遇到阻力为止。此时尼龙线前端已到达颈内动脉分叉为大脑中动脉和大脑前动脉处。手术组均分别予以左侧MCA阻断120 min后拔出尼龙线，恢复血流灌注。手术过程中保持环境温度在25℃～30℃，并用热垫维持大鼠体温。动物按Zausinger六分法2进行神经功能评分。0分：不能自发行走；1分：自由走动状态下向病变对侧旋转；2分：抓住鼠尾，大鼠向病变对侧旋转；3分：对于施向病变对侧的侧压力抵抗力下降者；4分：不能伸直病变对侧前爪，甚至全身向对侧屈曲；5分：无神经功能缺损。 假手术组只分离动脉而不行阻断。
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4.血脑屏障通透性测定：根据文献3制作依文士蓝标准曲线：称取依文士蓝4 mg置于容量瓶中，加生理盐水至总容积为25 mk，取0.3 mk于试管中，加入5.7 mk甲酰胺混匀作为第1管；从第1管取3 mk加入3 mk甲酰胺作为第2管；从第2管取3 mk加入3 mk甲酰胺作为第3管；依次类推共作7管，其浓度分别为8、4、2、1、0.25、0.125 ug/mk，60℃孵育24h后比色λ＝632测定OD值，计算线性回归方程。动物处死前2 h经尾静脉注入2%依文士蓝2 mk/kg，2 h后在10%水合氯醛麻醉下心内灌注生理盐水(200～300)mk，迅速断头取脑，解剖显微镜下去除额极和枕极各2 mm，左右半球分开，称取左半球湿重后置于甲酰胺1 mk/100 g脑组织中。60℃孵育24 h。1000 rpm离心5 min，分光光度计λ＝632测定上清液0D值。根据标准曲线计算缺血脑组织依文士蓝含量ug/g湿重。
5.血脑屏障超微结构观察：于大鼠再灌注后不同时间点迅速断头取脑，在大脑中动脉供血区取1 mm大小3～4小块脑组织，并用2.5%戊二醛固定2 h，用0.1 M磷酸缓冲液漂洗，1%锇酸后固定2 h。梯度酒精、丙酮脱水，618环氧树脂包埋液浸透包埋，FC 4D型超薄切片机切片(600～800) nm，醋酸铀、枸橼酸铅染色，CM-120透射电镜观察。
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6.表达测定：PCR引物参照文献设计MMP-94及内参照β-actin引物。引物序列如下：MMP-9 5 primer 5 AAG GAT GGT CTA CTG GCAC3；MMP-9 3 primer5 AGA GAT TCT CAC TGG GGC3；β-actin 5 primer5 ACT CCT ACG TGG GCG ACG AG3；β-actin 3 primer 5 CAG GTC CAG ACG CAG GAT GGC3。实验结束时各组动物分别于恢复再灌注后1、3、24、48 h和5 d，迅速断头取脑，解剖显微镜下切取距离额极(4～6) mm的脑片，-80℃冻存：常规方法抽提细胞总RNA，紫外分光光度计测定RNA在波长260 nm和280 nm的吸光度，进行定量和纯度检测并用电泳法鉴定其分子完整性。室温静置10 min，42℃60 min，70℃10 min，4℃5 min进行逆转录反应；逆转录后的cDNA保存于-20℃。反应循环参数为：94℃预变性5 min；94℃30 s、52℃30 s、72℃30 s37个循环；72℃延伸7 min。RT-PCR产物的分析和定量：取10 uk PCR扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳。电泳结束后进行电泳条带光密度分析，以靶基因条带光密度参数与内参基因β-actin条带的光密度参数比值作为该标本mRNA的表达水平参数。
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7.统计学处理：各组数据以均数标准差表示，用SAS6.0统计软件对数据进行分析，数据经正态分布检验，组间比较如满足方差齐性用t检验，不满足方差齐性用t′检验。P<0.05为具有统计学意义。
结果
1.通心络对MCAO大鼠神经功能缺损评分及梗塞体积的影响 大鼠MCAO后出现同侧Horner 综合征。麻醉清醒后出现对侧前后肢瘫痪以前肢为重。大鼠24小时存活率为100%。MCAO再灌注12小时，24小时、36小时、48小时的神经缺损积分随缺血再灌注时间延长而降低，较假手术组有显著差异(P<0.01)。通心络组各时间点神经功能缺损评分均显著高于MCAO再灌注组P0.05。提示祛风通络方药通心络能有效改善MCAO再灌注大鼠神经功能缺损积分。TTC染色显示，梗塞灶从第2脑片延伸至第6脑片，最大梗塞面积出现于第3、4脑片(前囟附近)。
MCAO再灌注组大鼠脑梗塞面积随梗塞时间延长而增大。梗塞灶位于受损半侧的顶、颞叶皮层及纹状体，以皮层梗塞为主。通心络组各时间点脑梗塞体积小于MCAO再灌注组。见表1、表2。
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表1. TXL对MCAO再灌注大鼠神经功能缺损评分的影响
神经功能缺损评分(χ±s，n=20)
组
12
24
36
48
SHAM
5
5
5
5
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MCAO
2.0±1.0
2.5±1.2
2.8±1.3
3.2±1.4
TXL
2.5±1.5
3.4±1.6
*
3.9±1.4
*
4.1±1.3
*
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注：*与MCAO组比较P<0.05
表2
TXL对MCAO再灌注24小时大鼠梗死体积的影响
组
病例数
梗死体积(mm3)
MCAO
20
112.21±21.2
TXL
20
86.54±17.51
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*
注：*与MCAO组比较P<0.05
2.通心络对MCAO再灌注大鼠血脑屏障通透性的影响 MCAO组大鼠依文士蓝含量于再灌注3小时与48小时呈现两个高峰。通心络组再灌注3小时依文士蓝含量与MCAO组无显著差异，但24小时、48小时及5天三个时间点依文士蓝含量均显著低于MCAO组P<0.01。提示通心络改善MCAO再灌注大鼠血脑屏障通透性的时间在24小时以后(见表3)。
表3. TXL对MCAO大鼠再灌注血脑屏障的影响(n＝20)
再灌注时间
组
1h
3h
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24h
48h
5d
SHAM
0.44±0.18
0.43±0.12
0.45±0.13
0.46±0.14
0.43±0.13
MCAO
3.99±0.59
*
, http://www.100md.com 6.91±2.84
*
4.08±0.54
*
9.16±3.27
*
4.66±2.13
*
TXL
3.06±0.51
6.65±3.28
3.02±0.52
#
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6.71±2.87
#
2.66±0.93
#
注：* 与Sham组比较P<0.05;#与MCAO组比较<0.05
3.通心络对MCAO大鼠MMP-9基因表达的影响 假手术组各时间点MMP-9 mRNA仅见微量表达。MCAO组大鼠再灌注24小时MMP-9基因表达开始增加，于48小时达到高峰，持续至第5天；通心络组24小时、48小时、5天的MMP-9 mRNA与MCAO比较均明显降低P<0.05。, 百拇医药(复旦大学附属中山医院 复旦大学中西医结合研究所 蔡定芳 闻名 戴巍 顾喜喜 范钰)