pSV-VEGF165肌肉原位注射促进兔缺血后肢毛细血管形成(1)
以下文章中[]表示参考文献
随着分子生物学不断发展,人们对血管生成机理的研究日益深入,一些与血管生成相关的基因不断被发现,从1991年起人们应用重组的促血管生长因子来促进缺血下肢侧支血管建立,这种疗法被称为治疗性血管生成(Theraputic angiogenesis)。对经传统治疗无效的严重下肢多节段多平面动脉阻塞性疾病患者来说,基因治疗有望成为一种新的疗法。本实验拟在兔缺血后肢肌肉内原位注射重组质粒pSV-VEGF165,观察缺血肢体内侧支血管生成情况。
材料与方法
1.质粒的制备和纯化
本实验采用的pSV-VEGF165是在质粒pSV-K3中插入含有165个氨基酸的VEGF转录本构建而成的,并经Qiagen-tip500质粒纯化试剂盒进行抽提和纯化,260nm测OD后,调整质粒浓度为1μg/μl,4℃条件下储存备用。
, 百拇医药
2.肢体动脉缺血动物模型的建立
取雄性新西兰兔14只,2.5Kg-3.2Kg,以2%戊巴比妥钠静脉麻醉(1mg/Kg)。仰卧位,从右腹股沟韧带下至髌骨上取纵行切口,游离股浅动脉及其分支,在其近端结扎髂外动脉,在其远端结扎掴动脉和隐动脉后,切除股浅动脉全长,结扎途中包括股深动脉和旋外动脉在内的所有分支。在髂外动脉和隐动脉残端分别放置银夹标记。
3.肌肉内原位基因转染
将14只新西兰兔随机分为两组:基因治疗组、对照组,每组各7例。造模术后第21天,循原切口切开皮肤,暴露股内侧肌群。用无损伤丝线缝扎部分肌外膜以作标记,在标记处用1 mlTB注射器将pSV-VEGF165分5点缓慢注射于股内侧肌群。每点注射剂量200μg,针头外套塑料套管以固定注射深度保持在2mm。对照组注射等量质粒pSV-K3。
4.毛细血管密度和毛细血管/ 肌肉数比值测定 所有实验兔均于质粒注射后30天,切取右侧缺血后肢大腿质粒注射部位肌组织块和小腿胫前肌组织块,并取左侧非缺血后肢大腿肌组织块作为正常空白对照。所取标本立即置于-140℃异戊烷预处理25秒后液氮内保存。所有标本在恒冷切片机上冰冻切片,厚5μm,冷丙酮固定10min,用0.1M Tris-HCl(含0.1M NaCl,0.05M MgCl2 pH9.5)充分洗涤后,加入显色液(0.1M Tris-HCl 10ml pH9.5,x-phosphate 35μl,NBT 45μl),37℃暗培养5小时,流水洗涤后伊红衬染,乙醇梯度脱水,中性树胶封片。光镜下观察骨骼肌细胞呈红色,毛细血管呈蓝色颗粒。每个标本随机选取20个视野,在20倍放大下用VIDAS计算机图像处理系统测定单位视野(125720.4μm2)下蓝染面积,计算毛细血管密度(单位视野蓝染面积/单位视野面积)和毛细血管/肌肉数之比(单位视野蓝染颗粒/单位视野肌肉数)。
, 百拇医药
所得数据采用SAS软件包行方差分析。
结 果
除对照组有1只兔因腹泻死亡外,其余均存活。对照组有3只兔缺血肢体出现溃疡，而治疗组无一例发生。
毛细血管密度和毛细血管/肌肉数比值测定结果:兔正常后肢肌组织内毛细血管密度为2108.33±35.96μm2,毛细血管/肌肉数比值为0.432±0.028。在大腿质粒注射部位和小腿部位,pSV-VEGF165治疗组的毛细血管密度分别为:3049.98±244.40μm2、5074.08±199.14μm2(表1);毛细血管/肌肉数比值,在大腿肌组织为0.659±0.031，小腿为0.954±0.017(表2),两者均明显高于pSV-K3对照组和正常对照肢体,并有显著的统计学差异(P0.05)。在pSV-VEGF165治疗组中,小腿部位毛细血管密度和毛细血管/肌肉数比值均较大腿质粒注射部位有显著增高(P0.05)(见表1、表2)。, http://www.100md.com(赵意平 施娅雪 何天源 张皓 陈诗书 张柏根)
随着分子生物学不断发展,人们对血管生成机理的研究日益深入,一些与血管生成相关的基因不断被发现,从1991年起人们应用重组的促血管生长因子来促进缺血下肢侧支血管建立,这种疗法被称为治疗性血管生成(Theraputic angiogenesis)。对经传统治疗无效的严重下肢多节段多平面动脉阻塞性疾病患者来说,基因治疗有望成为一种新的疗法。本实验拟在兔缺血后肢肌肉内原位注射重组质粒pSV-VEGF165,观察缺血肢体内侧支血管生成情况。
材料与方法
1.质粒的制备和纯化
本实验采用的pSV-VEGF165是在质粒pSV-K3中插入含有165个氨基酸的VEGF转录本构建而成的,并经Qiagen-tip500质粒纯化试剂盒进行抽提和纯化,260nm测OD后,调整质粒浓度为1μg/μl,4℃条件下储存备用。
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2.肢体动脉缺血动物模型的建立
取雄性新西兰兔14只,2.5Kg-3.2Kg,以2%戊巴比妥钠静脉麻醉(1mg/Kg)。仰卧位,从右腹股沟韧带下至髌骨上取纵行切口,游离股浅动脉及其分支,在其近端结扎髂外动脉,在其远端结扎掴动脉和隐动脉后,切除股浅动脉全长,结扎途中包括股深动脉和旋外动脉在内的所有分支。在髂外动脉和隐动脉残端分别放置银夹标记。
3.肌肉内原位基因转染
将14只新西兰兔随机分为两组:基因治疗组、对照组,每组各7例。造模术后第21天,循原切口切开皮肤,暴露股内侧肌群。用无损伤丝线缝扎部分肌外膜以作标记,在标记处用1 mlTB注射器将pSV-VEGF165分5点缓慢注射于股内侧肌群。每点注射剂量200μg,针头外套塑料套管以固定注射深度保持在2mm。对照组注射等量质粒pSV-K3。
4.毛细血管密度和毛细血管/ 肌肉数比值测定 所有实验兔均于质粒注射后30天,切取右侧缺血后肢大腿质粒注射部位肌组织块和小腿胫前肌组织块,并取左侧非缺血后肢大腿肌组织块作为正常空白对照。所取标本立即置于-140℃异戊烷预处理25秒后液氮内保存。所有标本在恒冷切片机上冰冻切片,厚5μm,冷丙酮固定10min,用0.1M Tris-HCl(含0.1M NaCl,0.05M MgCl2 pH9.5)充分洗涤后,加入显色液(0.1M Tris-HCl 10ml pH9.5,x-phosphate 35μl,NBT 45μl),37℃暗培养5小时,流水洗涤后伊红衬染,乙醇梯度脱水,中性树胶封片。光镜下观察骨骼肌细胞呈红色,毛细血管呈蓝色颗粒。每个标本随机选取20个视野,在20倍放大下用VIDAS计算机图像处理系统测定单位视野(125720.4μm2)下蓝染面积,计算毛细血管密度(单位视野蓝染面积/单位视野面积)和毛细血管/肌肉数之比(单位视野蓝染颗粒/单位视野肌肉数)。
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所得数据采用SAS软件包行方差分析。
结 果
除对照组有1只兔因腹泻死亡外,其余均存活。对照组有3只兔缺血肢体出现溃疡，而治疗组无一例发生。
毛细血管密度和毛细血管/肌肉数比值测定结果:兔正常后肢肌组织内毛细血管密度为2108.33±35.96μm2,毛细血管/肌肉数比值为0.432±0.028。在大腿质粒注射部位和小腿部位,pSV-VEGF165治疗组的毛细血管密度分别为:3049.98±244.40μm2、5074.08±199.14μm2(表1);毛细血管/肌肉数比值,在大腿肌组织为0.659±0.031，小腿为0.954±0.017(表2),两者均明显高于pSV-K3对照组和正常对照肢体,并有显著的统计学差异(P0.05)。在pSV-VEGF165治疗组中,小腿部位毛细血管密度和毛细血管/肌肉数比值均较大腿质粒注射部位有显著增高(P0.05)(见表1、表2)。, http://www.100md.com(赵意平 施娅雪 何天源 张皓 陈诗书 张柏根)