胆汁成核效应蛋白的研究进展(1)
一、促成核蛋白体系的组成
1.非刀豆球蛋白A(ConA)结合蛋白：
这组蛋白质因无甘露糖基与ConA不能结合，且易受蛋白水解酶链霉蛋白酶(pronase)作用而致活性丧失。胆囊粘膜分泌的粘蛋白是文献最早报道的非ConA结合促成核蛋白，模拟胆汁体系中结晶生长实验证实粘蛋白不仅具有促成核作用，而且能抑制胆固醇结晶的形成。Grone等在T管胆汁中发现另外一种分子量约为30000的非ConA结合蛋白，对热稳定，37℃孵育24h促成核活性几乎不受影响。因与抑成核蛋白共存于非ConA结合部分，分离纯化较困难，其理化性质有待进一步研究。
2.ConA结合蛋白：
(1)免疫球蛋白(Ig)：胆汁中ConA结合部分IgA，IgG及IgM的浓度分别为(171±85)μg/ml，(63±49)μg/ml及(53±38)μg/ml。在模拟胆汁体系中Ig明显具促成核作用，其促成核活性强弱依次为IgM>IgA>IgG。但用相应的特异性抗体免疫吸附去除Ig，ConA结合蛋白总促成核活性丢失不到10%，推测ConA结合蛋白中尚有其他促成核因子，胆汁中绝大部分IgA和IgM是以非ConA结合形成存在的。
, 百拇医药
(2)α酸性糖蛋白(AAG)：Abei等发现相对分子质量(Mr)42000糖蛋白不仅存在于胆石症病人，而且也存在于正常人群，氨基酸序列分析及特异性免疫结合反应表明胆汁中Mr42000成核活性蛋白是α酸性糖蛋白。ELISA法测定多发胆固醇结石病人胆汁中AAG绝对浓度为(59±61)μg/ml，比非胆石症组高出3～5倍，但在单发结石组未发现AAG明显升高。理化性质研究示该蛋白质等电点呈酸性(pI<4)，可能与含有大量唾液酸有关，脱糖基后多肽骨架Mr为26000，氨基酸组成分析示大部分为Gln，Asp和Leu。成核活性实验研究发现胆汁中AAG浓度与成核时间成负相关(P<0.05)，用鼠抗人AAG抗体免疫吸附ConA结合部分中AAG，总ConA蛋白促成核活性约减少1/3，表明AAG是ConA结合蛋白中强促成核活性因子。
(3)低密度颗粒(LDP)：将胆囊胆汁和T管胆汁经ConA Sepharose柱过筛预处理后，洗脱液以KBr密度梯度超速离心，发现LDP位于离心条带的低密度区(1.08)。成分研究示主要由胆固醇、游离脂肪酸、磷脂及少量蛋白质组成。该蛋白质Mr约85000，SDSPAGE电涤带弥散，提示其具很强的疏水性。由于N端封闭，未能进行氨基酸序列分析鉴定其性质和结构。负染和冰冻蚀刻电镜示LDP无双层或板层结构，表明LDP不是强促成核活性的胆汁泡。成核动力学实验提示LDP主要参与胆固醇成核过程，而对结晶生长阶段作用不大；脱去脂类后该颗粒活性丧失，但其成核活性不受链霉蛋白酶消化降解的影响。
, 百拇医药
(4)氨基肽N(APN)：Groen等在胆固醇结石病人胆囊胆汁中分离出Mr130000糖蛋白，具有明显促成核作用。80℃加热30min促成核活性全部丧失，将糖苷酶与其混匀孵育水解糖基后促成核活性亦随之丢失，表明Mr130000糖蛋白是热不稳定蛋白，其中糖基参与调节其促成核作用。随后Zijlstra等和Offner等证实了肝胆汁和胆囊胆汁中具促成核活性的Mr130000糖蛋白是APN。尽管胆汁中血浆铜蓝蛋白Mr亦为130000，但该蛋白质无促成核活性，氨基酸序列分析基本上予以排除。进一步研究胆囊粘膜匀浆和白胆汁，两者均未发现APN，提示APN来源于肝脏分泌抑或胆管上皮。
(5)α1抗糜/胰蛋白酶(ACT/ATR)：两者均属急性期反应蛋白，Mr分别为60000和50000。存在于胆固醇结石病人T管胆汁中的ATR和ACT氨基酸组成结构与文献报道的血浆中成分不全一致，其N端已水解16个氨基酸。ACT与ATR的成核活性不受链霉蛋白酶影响，减法实验表明ACT是ConA结合蛋白重要的促成核部分，将ACT加入模拟胆汁体系亦能明显促进胆固醇结晶成核和生长作用；但ATR未见类似现象。, 百拇医药(项建斌 蔡端 张延龄)
1.非刀豆球蛋白A(ConA)结合蛋白：
这组蛋白质因无甘露糖基与ConA不能结合，且易受蛋白水解酶链霉蛋白酶(pronase)作用而致活性丧失。胆囊粘膜分泌的粘蛋白是文献最早报道的非ConA结合促成核蛋白，模拟胆汁体系中结晶生长实验证实粘蛋白不仅具有促成核作用，而且能抑制胆固醇结晶的形成。Grone等在T管胆汁中发现另外一种分子量约为30000的非ConA结合蛋白，对热稳定，37℃孵育24h促成核活性几乎不受影响。因与抑成核蛋白共存于非ConA结合部分，分离纯化较困难，其理化性质有待进一步研究。
2.ConA结合蛋白：
(1)免疫球蛋白(Ig)：胆汁中ConA结合部分IgA，IgG及IgM的浓度分别为(171±85)μg/ml，(63±49)μg/ml及(53±38)μg/ml。在模拟胆汁体系中Ig明显具促成核作用，其促成核活性强弱依次为IgM>IgA>IgG。但用相应的特异性抗体免疫吸附去除Ig，ConA结合蛋白总促成核活性丢失不到10%，推测ConA结合蛋白中尚有其他促成核因子，胆汁中绝大部分IgA和IgM是以非ConA结合形成存在的。
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(2)α酸性糖蛋白(AAG)：Abei等发现相对分子质量(Mr)42000糖蛋白不仅存在于胆石症病人，而且也存在于正常人群，氨基酸序列分析及特异性免疫结合反应表明胆汁中Mr42000成核活性蛋白是α酸性糖蛋白。ELISA法测定多发胆固醇结石病人胆汁中AAG绝对浓度为(59±61)μg/ml，比非胆石症组高出3～5倍，但在单发结石组未发现AAG明显升高。理化性质研究示该蛋白质等电点呈酸性(pI<4)，可能与含有大量唾液酸有关，脱糖基后多肽骨架Mr为26000，氨基酸组成分析示大部分为Gln，Asp和Leu。成核活性实验研究发现胆汁中AAG浓度与成核时间成负相关(P<0.05)，用鼠抗人AAG抗体免疫吸附ConA结合部分中AAG，总ConA蛋白促成核活性约减少1/3，表明AAG是ConA结合蛋白中强促成核活性因子。
(3)低密度颗粒(LDP)：将胆囊胆汁和T管胆汁经ConA Sepharose柱过筛预处理后，洗脱液以KBr密度梯度超速离心，发现LDP位于离心条带的低密度区(1.08)。成分研究示主要由胆固醇、游离脂肪酸、磷脂及少量蛋白质组成。该蛋白质Mr约85000，SDSPAGE电涤带弥散，提示其具很强的疏水性。由于N端封闭，未能进行氨基酸序列分析鉴定其性质和结构。负染和冰冻蚀刻电镜示LDP无双层或板层结构，表明LDP不是强促成核活性的胆汁泡。成核动力学实验提示LDP主要参与胆固醇成核过程，而对结晶生长阶段作用不大；脱去脂类后该颗粒活性丧失，但其成核活性不受链霉蛋白酶消化降解的影响。
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(4)氨基肽N(APN)：Groen等在胆固醇结石病人胆囊胆汁中分离出Mr130000糖蛋白，具有明显促成核作用。80℃加热30min促成核活性全部丧失，将糖苷酶与其混匀孵育水解糖基后促成核活性亦随之丢失，表明Mr130000糖蛋白是热不稳定蛋白，其中糖基参与调节其促成核作用。随后Zijlstra等和Offner等证实了肝胆汁和胆囊胆汁中具促成核活性的Mr130000糖蛋白是APN。尽管胆汁中血浆铜蓝蛋白Mr亦为130000，但该蛋白质无促成核活性，氨基酸序列分析基本上予以排除。进一步研究胆囊粘膜匀浆和白胆汁，两者均未发现APN，提示APN来源于肝脏分泌抑或胆管上皮。
(5)α1抗糜/胰蛋白酶(ACT/ATR)：两者均属急性期反应蛋白，Mr分别为60000和50000。存在于胆固醇结石病人T管胆汁中的ATR和ACT氨基酸组成结构与文献报道的血浆中成分不全一致，其N端已水解16个氨基酸。ACT与ATR的成核活性不受链霉蛋白酶影响，减法实验表明ACT是ConA结合蛋白重要的促成核部分，将ACT加入模拟胆汁体系亦能明显促进胆固醇结晶成核和生长作用；但ATR未见类似现象。, 百拇医药(项建斌 蔡端 张延龄)