组合性人工肝的临床研究现状(1)
因感染、药物或多器官功能衰竭等所致的肝功能衰竭，目前的发病率、死亡率仍然很高。其治疗仍局限于内科的护肝支持治疗，甚至原位肝移植(orthotopic liver transplantation，OLT)。基于这些治疗的局限性，近年来随着细胞学技术、生物工程学技术的发展，组合性人工肝(hybrid artificial liver)或称肝细胞支持系统(hepatocyte liver assist systems，LAS)的建立和临床试验成为研究热点，并已可望成为临时和长期肝支持治疗的方法。目前，由哺乳动物肝细胞培养系统与解毒装置如活性炭吸附柱共同构建的LAS已可以提供肝脏的解毒、分泌、合成与转化等功能，并且在肝功能衰竭病人中至少有3例临床试验已取得明显效果。美国食品与药品管理局(FDA)已批准一种LAS进行多中心临床试验。LAS的研究已取得巨大进展，当然仍有一些问题未能解决。本文将对其现状及临床应用作一综述。
一、肝细胞来源及培养
, 百拇医药
人类肝细胞和动物肝细胞在LAS的临床试验中都有应用。人肝细胞是理想的来源 ，它合成人的蛋白质和酶类，但人肝细胞供应受限。人肝细胞系如C3A细胞系、HepG2细胞系(源于儿童肝母细胞瘤)均易于培养，生长迅速，供应不受限制，但常缺少重要的代谢功能，如HepG2细胞缺乏尿素合成功能；C3A、HepG2细胞缺乏P450解离酶的功能；此外尚存在潜在致癌危险性。在动物肝细胞应用中，鼠肝细胞通常应用在肝细胞功能研究和一些小型LAS研究，啮齿动物肝细胞在临床治疗中不适用。临床实验中，猪肝细胞分离已获得成功。已有几种技术可用于大量猪肝细胞的分离。猪肝细胞的优点是供应充足，大量临床经验是在猪肝细胞构建的LAS临床试验中获得，最近美国FDA已批准猪肝细胞构建的LAS用于多中心临床试验，但在理论上及实践观察中发现，猪肝细胞的缺点是猪源性蛋白的暴露带来相关的免疫问题，并且可能引起潜在的动物源性疾病。所以必须搞清猪源性病毒的潜在转移可能，如猪内源性逆转录病毒和E型肝炎病毒，以确保体外灌注期间病人的安全。
肝细胞培养技术由最初的单层发展到如多层平板型、胶原三明治状、球形聚集肝细胞、微囊肝细胞、微载体肝细胞培养、聚己酰内酯培养等。分离后的肝细胞需要固定在基质上如微载体或多孔材料如树脂、微型海绵等。目前常用的是将细胞固定后粘附到中空纤维壁外或腔内培养构建成生物反应器。
, 百拇医药
二、细胞量
LAS中需要多少肝细胞才能维持病人的肝功能仍需要进一步研究。根据实验研究结果，仅剩10%～30%正常肝实质仍可维持病人生存需要。肝细胞约占肝实质总量的90%，正常人肝脏重约1500g，由此可估计出LAS中应至少植入100～400g肝细胞。在临床实验中LAS中肝细胞少于100g却仍能降低急性肝衰病人的肝性脑病发生率，这提示在LAS支持治疗过程中，生物反应器中的肝细胞不仅提供代谢功能，而且对病人的肝脏有积极的影响。
三、免疫问题
LAS和肝移植在免疫排斥反应的控制方法上不同，它是用一种半透膜代替肝移植中的免疫抑制药物。在体液免疫方面,Baquerizo等报道在用猪肝细胞构建的LAS治疗期间，病人血中抗猪抗体的滴定度增高，并认为这可能是由于猪抗原穿过LAS中直径只有200nm的中空纤维膜所致；第一次LAS治疗后抗猪抗体并不升高，而多次治疗后升高2～3倍，肝移植的病人应用免疫抑制剂后抗体水平反应性降低；而一例未行肝移植，肝功能自主恢复的病人血中抗猪抗体滴度一直保持较高水平。在这项研究中抗猪抗体没有对机体产生副作用，而抗猪抗体的细胞毒性作用对LAS中猪肝细胞的影响仍未明确。细胞免疫方面尚未见报道。理论上病人机体的T淋巴细胞在LAS治疗期间有可能被猪抗原激活，猪抗原穿过LAS的生物反应器中空纤维膜进入血循环，被抗原提呈细胞(APC)摄取、加工，并与T淋巴细胞上CD4+受体结合产生免疫应答。这种间接的抗原提呈在其他异种免疫反应中的重要性已被证实。激活的T淋巴细胞可产生多种细胞因子如IL1、TNF等，已证实这些细胞因子在急性肝衰期间对肝脏有损害作用。同样它们对LAS中的肝细胞也有毒性作用。, 百拇医药(蒋泽生 杨继震 高毅)
一、肝细胞来源及培养
, 百拇医药
人类肝细胞和动物肝细胞在LAS的临床试验中都有应用。人肝细胞是理想的来源 ，它合成人的蛋白质和酶类，但人肝细胞供应受限。人肝细胞系如C3A细胞系、HepG2细胞系(源于儿童肝母细胞瘤)均易于培养，生长迅速，供应不受限制，但常缺少重要的代谢功能，如HepG2细胞缺乏尿素合成功能；C3A、HepG2细胞缺乏P450解离酶的功能；此外尚存在潜在致癌危险性。在动物肝细胞应用中，鼠肝细胞通常应用在肝细胞功能研究和一些小型LAS研究，啮齿动物肝细胞在临床治疗中不适用。临床实验中，猪肝细胞分离已获得成功。已有几种技术可用于大量猪肝细胞的分离。猪肝细胞的优点是供应充足，大量临床经验是在猪肝细胞构建的LAS临床试验中获得，最近美国FDA已批准猪肝细胞构建的LAS用于多中心临床试验，但在理论上及实践观察中发现，猪肝细胞的缺点是猪源性蛋白的暴露带来相关的免疫问题，并且可能引起潜在的动物源性疾病。所以必须搞清猪源性病毒的潜在转移可能，如猪内源性逆转录病毒和E型肝炎病毒，以确保体外灌注期间病人的安全。
肝细胞培养技术由最初的单层发展到如多层平板型、胶原三明治状、球形聚集肝细胞、微囊肝细胞、微载体肝细胞培养、聚己酰内酯培养等。分离后的肝细胞需要固定在基质上如微载体或多孔材料如树脂、微型海绵等。目前常用的是将细胞固定后粘附到中空纤维壁外或腔内培养构建成生物反应器。
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二、细胞量
LAS中需要多少肝细胞才能维持病人的肝功能仍需要进一步研究。根据实验研究结果，仅剩10%～30%正常肝实质仍可维持病人生存需要。肝细胞约占肝实质总量的90%，正常人肝脏重约1500g，由此可估计出LAS中应至少植入100～400g肝细胞。在临床实验中LAS中肝细胞少于100g却仍能降低急性肝衰病人的肝性脑病发生率，这提示在LAS支持治疗过程中，生物反应器中的肝细胞不仅提供代谢功能，而且对病人的肝脏有积极的影响。
三、免疫问题
LAS和肝移植在免疫排斥反应的控制方法上不同，它是用一种半透膜代替肝移植中的免疫抑制药物。在体液免疫方面,Baquerizo等报道在用猪肝细胞构建的LAS治疗期间，病人血中抗猪抗体的滴定度增高，并认为这可能是由于猪抗原穿过LAS中直径只有200nm的中空纤维膜所致；第一次LAS治疗后抗猪抗体并不升高，而多次治疗后升高2～3倍，肝移植的病人应用免疫抑制剂后抗体水平反应性降低；而一例未行肝移植，肝功能自主恢复的病人血中抗猪抗体滴度一直保持较高水平。在这项研究中抗猪抗体没有对机体产生副作用，而抗猪抗体的细胞毒性作用对LAS中猪肝细胞的影响仍未明确。细胞免疫方面尚未见报道。理论上病人机体的T淋巴细胞在LAS治疗期间有可能被猪抗原激活，猪抗原穿过LAS的生物反应器中空纤维膜进入血循环，被抗原提呈细胞(APC)摄取、加工，并与T淋巴细胞上CD4+受体结合产生免疫应答。这种间接的抗原提呈在其他异种免疫反应中的重要性已被证实。激活的T淋巴细胞可产生多种细胞因子如IL1、TNF等，已证实这些细胞因子在急性肝衰期间对肝脏有损害作用。同样它们对LAS中的肝细胞也有毒性作用。, 百拇医药(蒋泽生 杨继震 高毅)