哺乳动物睾丸细胞株的建立及应用(2)
1.2 方法 将重组质粒上的克隆化基因引入哺乳动物细胞有几种供选择的方法。在磷酸钙法中,质粒DNA通过可以粘附到细胞表面的沉淀被引入单层细胞或悬浮培养的细胞。DEAE 葡聚糖方法也使含有DNA和DEAE 葡聚糖大复合物粘附到细胞表面。在这两种方法中 ,DNA复合物可能是通过内吞作用摄取的,但对细胞是如何将DAN吞入,并将其转到核内机制的了解甚少。在转染介质中使用氯喹能提高转染效率。氯喹通过中和囊泡内的pH值来抑制溶酶体中的DAN酶 ,而磷酸钙和DEAE 葡聚糖介导的DNA转染正是通过溶酶体转运的。有人介绍用阳离子脂质体来介导细胞DNA的摄取方法。带上正电荷 ,中性脂质形成含有核酸的脂质体,当把这些脂质核酸复合物加入到培养的细胞时,它们很容易整合入胞膜的脂质双层内,因此方便了核酸的摄取。
电穿孔法是在盛有哺乳动物细胞悬液的金属箔衬试管中,产生高压脉冲使DNA线性化。这时细胞变得对DNA具有可透性并将其摄入,磷酸钙和电穿孔法是允许导入细胞的DNA整合入基因组而产生稳定转化的仅有方法。DEAE 葡聚糖和阳离子脂质体法仅用于转染基因的短暂表达。因为原代的睾丸细胞特别是生殖细胞非常脆弱,用电穿孔法来获取稳定转化子太剧烈 ,所以首选磷酸钙法。
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1.3 结果 Hofmann等人利用sv40lt抗原作为永生剂 ,将该基因用磷酸钙法转染10天龄小鼠睾丸的分离亚群 ,建立了 47个细胞株。永生的管周细胞株经鉴定具有梭形外貌 ,高表达碱性磷酸酶并表达中间丝结合蛋白。这些细胞也产生大量胶原蛋白。永生的间质细胞株在胞质中有脂质小滴的聚集 ,同时细胞还产生 3β-OL羟甾类脱氢酶。放射活性的激素结合分析发现,至少有 3个间质细胞株在细胞表面表达LH受体 ,然而在细胞群体中,这种表达具有不均一性 ,在特定培养条件下有 1%～5%的细胞LH受体阳性 ,这些受体阳性细胞常成团存在。所有的间质细胞株都不产生可测量的睾酮。但是,考虑到原始细胞来源于青春期前的10天龄小鼠睾丸,这个发现并不能作为阴性结果。永生的支持细胞在高密度培养时,能形成体内正常的圆柱形。电镜观察发现这种细胞还具有典型的锯齿形核和胞质内吞噬小体,至少有3个支持细胞株在细胞表面表达FSH受体。然而生殖细胞株GC-1spg的建立可能更重要。电镜和免疫细胞化学显示 ,细胞具有B型精原细胞和初级精母细胞的特性。在超微结构水平,该细胞核大,含有大量的块状染色质,类似于B型精原细胞和细线期前精母细胞。这是首次描述这种细胞株 ,它表达精母细胞和精子发生后期特异的生殖细胞标记物质 细胞色素氧化酶Ct的异构体和LDH C4同工酶。
, 百拇医药
2 体外精细胞索和它们对生殖细胞特异基因启动子分析方面的应用
这些永生的体细胞和生殖细胞株的一个特性,是能联合并重建三维的条索状结构。当这四种细胞按一定比例接种在一起 (16%支持细胞、16%间质细胞、16%管周细胞和50%生精细胞 ),便能形成条索状的结构。GC-1 spg细胞经常出现在这些结构的中心;在生殖细胞岛之间的空隙,则由其他三种体细胞的混合群体占据。每种类型细胞的特异定位和分布,是通过用特异的细胞或免疫细胞化学标记物染色这种结构来分辨的,如结合蛋白和碱性磷酸酶,以及通过极重要的二碘化物染色来标记特异的细胞类型。体外去除GC-1 spg细胞,专门培养体细胞也能形成条索状结构。这种结构由支持细胞和管周细胞构成,而间质细胞仍位于条索状结构之外。这些条索状结构能使新鲜分离的粗线期精母细胞较长时间存活。用单位重力沉降速度法分离的粗线期精母细胞与支持细胞、管周细胞和间质细胞一起培养,这些原代生精细胞能掺入条索状结构中,并能存活10～15天。这些结构也为我们研究生殖细胞特异基因产物,如ldh-c4的表达提供了良好的手段。睾丸特异的乳酸脱氢酶同工酶LDH4仅存在于精子中和睾丸中,这种表达局限于生精上皮,始于细线前期,持续到精子发生的全过程。cooker等已完成了人类ldh-c基因的克隆和特征描述,包括假定的调节元件。人类ldh-c基因组DNA外显子Ⅰ上游富含GC,不含明显的TATA和CAAT同源序列。一个推定的 180bp调节序列位于人类ldh-c基因的5′端 ,将该序列插入载体LacZ报告基因的上游区段。结果显示新鲜分离的粗线期精母细胞,经过转染能在条索状结构中存活 ,并表达ldh-c基因的180bp启动子结构。, 百拇医药(娄利霞 张亦清 贾孟春)
电穿孔法是在盛有哺乳动物细胞悬液的金属箔衬试管中,产生高压脉冲使DNA线性化。这时细胞变得对DNA具有可透性并将其摄入,磷酸钙和电穿孔法是允许导入细胞的DNA整合入基因组而产生稳定转化的仅有方法。DEAE 葡聚糖和阳离子脂质体法仅用于转染基因的短暂表达。因为原代的睾丸细胞特别是生殖细胞非常脆弱,用电穿孔法来获取稳定转化子太剧烈 ,所以首选磷酸钙法。
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1.3 结果 Hofmann等人利用sv40lt抗原作为永生剂 ,将该基因用磷酸钙法转染10天龄小鼠睾丸的分离亚群 ,建立了 47个细胞株。永生的管周细胞株经鉴定具有梭形外貌 ,高表达碱性磷酸酶并表达中间丝结合蛋白。这些细胞也产生大量胶原蛋白。永生的间质细胞株在胞质中有脂质小滴的聚集 ,同时细胞还产生 3β-OL羟甾类脱氢酶。放射活性的激素结合分析发现,至少有 3个间质细胞株在细胞表面表达LH受体 ,然而在细胞群体中,这种表达具有不均一性 ,在特定培养条件下有 1%～5%的细胞LH受体阳性 ,这些受体阳性细胞常成团存在。所有的间质细胞株都不产生可测量的睾酮。但是,考虑到原始细胞来源于青春期前的10天龄小鼠睾丸,这个发现并不能作为阴性结果。永生的支持细胞在高密度培养时,能形成体内正常的圆柱形。电镜观察发现这种细胞还具有典型的锯齿形核和胞质内吞噬小体,至少有3个支持细胞株在细胞表面表达FSH受体。然而生殖细胞株GC-1spg的建立可能更重要。电镜和免疫细胞化学显示 ,细胞具有B型精原细胞和初级精母细胞的特性。在超微结构水平,该细胞核大,含有大量的块状染色质,类似于B型精原细胞和细线期前精母细胞。这是首次描述这种细胞株 ,它表达精母细胞和精子发生后期特异的生殖细胞标记物质 细胞色素氧化酶Ct的异构体和LDH C4同工酶。
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2 体外精细胞索和它们对生殖细胞特异基因启动子分析方面的应用
这些永生的体细胞和生殖细胞株的一个特性,是能联合并重建三维的条索状结构。当这四种细胞按一定比例接种在一起 (16%支持细胞、16%间质细胞、16%管周细胞和50%生精细胞 ),便能形成条索状的结构。GC-1 spg细胞经常出现在这些结构的中心;在生殖细胞岛之间的空隙,则由其他三种体细胞的混合群体占据。每种类型细胞的特异定位和分布,是通过用特异的细胞或免疫细胞化学标记物染色这种结构来分辨的,如结合蛋白和碱性磷酸酶,以及通过极重要的二碘化物染色来标记特异的细胞类型。体外去除GC-1 spg细胞,专门培养体细胞也能形成条索状结构。这种结构由支持细胞和管周细胞构成,而间质细胞仍位于条索状结构之外。这些条索状结构能使新鲜分离的粗线期精母细胞较长时间存活。用单位重力沉降速度法分离的粗线期精母细胞与支持细胞、管周细胞和间质细胞一起培养,这些原代生精细胞能掺入条索状结构中,并能存活10～15天。这些结构也为我们研究生殖细胞特异基因产物,如ldh-c4的表达提供了良好的手段。睾丸特异的乳酸脱氢酶同工酶LDH4仅存在于精子中和睾丸中,这种表达局限于生精上皮,始于细线前期,持续到精子发生的全过程。cooker等已完成了人类ldh-c基因的克隆和特征描述,包括假定的调节元件。人类ldh-c基因组DNA外显子Ⅰ上游富含GC,不含明显的TATA和CAAT同源序列。一个推定的 180bp调节序列位于人类ldh-c基因的5′端 ,将该序列插入载体LacZ报告基因的上游区段。结果显示新鲜分离的粗线期精母细胞,经过转染能在条索状结构中存活 ,并表达ldh-c基因的180bp启动子结构。, 百拇医药(娄利霞 张亦清 贾孟春)