哺乳动物睾丸细胞株的建立及应用(3)
3 联合应用sv40lt抗原和温度敏感p53建立生殖细胞株
3.1 原理 为了试图调整sv40lt抗原的不朽化特性,以提高能在体外建立分化的生殖细胞株的可能性,实验者应用了p53结合lt抗原的特性。有人研究了Wtp53的过量表达对sv40转化启始和维持的抑制作用。发现小鼠Wtp53对于sv40lt抗原转化效应具有抑制和逆转功能。Wtp53在sv40转化过程中表现抑癌基因的功能,在转换期前细胞Wtp 53在转化起始和维持中都有抗转化功能。从而提出了关于p53 sv40lt抗原复合物在转化表型的诱导和维持中功能的假说。该假说认为这个复合物抑制了Wtp 53的功能,因此,导致了转化表型的表达。已有证据表明,当两种分子同时在转换期前的小鼠成纤维细胞中表达时,野生型p53蛋白的过量表达能消除lt抗原的增殖功能。温度敏感的p53蛋白,可在非允许温度39℃下失活 ,仍存在于突变的cDNA稳定转染的细胞胞质内。在允许温度37℃或32℃下,突变的温度敏感p53蛋白呈现野生型结构 ,并定位于细胞核内。因此 ,原代生殖细胞用lt抗原和温度敏感的p53共同转染而永生 ,因而可以推测:在39℃ ,lt抗原将使细胞发生不朽化 ,而温度敏感型p53蛋白将失活并局限于胞质内。如果不朽化细胞的培养温度转变为37℃或32℃ ,温度敏感型p53将具有活性结构 ,在细胞核内表现野生型的特性 ,抵消lt抗原的作用 ,使细胞继续分化。
, 百拇医药
3.2 结果 Hofmann等人用这种方法转染富含细线前期精母细胞的生殖细胞群 ,建立了一个称为GC-2spd(ts)的生殖细胞株。在39℃下低密度培养,细胞呈现大的球形;当汇合时,细胞变成梭形。细胞贴附于组织培养皿快速生长,倍增时间为18h,并和预期的一样,p53蛋白仅在胞质中存在。在这个温度下,LDHC4和细胞色素酶同工酶分别呈现低的或不能被检测到的表达。在37℃下,细胞生长缓慢,倍增时间为24h。p53蛋白在细胞核和细胞质中都有表达,并且两种酶的表达增加。形态学特征表明,这些细胞具有早期精子细胞的特性。对37℃和39℃下培养的GC-2spd(ts)细胞的早期传代细胞(10代)的细胞计数分析 ,显示了存在二倍体和四倍体DNA含量,37℃下培养此细胞 85天以上,将出现第三个明显的单倍体高峰,并随时间而增长,直至细胞总数的28.4%(30代)。对有丝分裂细胞的染色体分析表明,GCWtp细胞单倍体期的染色体总数为20～21。在32℃下,细胞的增殖速度逐渐下降,在此温度下,平均10代以后细胞死亡。电镜分析证实,在32℃下GC-2spd(ts)细胞形成鞭毛轴,这进一步证实了这些细胞的部分群体具有早期精子细胞的特征。180bp的ldhc基因的启动子结构 ,在GC-2spd(ts)细胞中能有效地表达,但在体细胞中没有检测到这种表达,这与体内这种基因的表达一致。然而 ,在GC-2spd(ts)的体外长期培养中(大约2年),它们的分化能力并不能维持。这可能是由于长时间lt抗原所诱导的累积变化 ,抑制了细胞不朽化的逆转,正如其他体系中所表现的。温度敏感p53的整合并不是稳定到足以持续产生足够量的野生型蛋白,但这些变化的确切机制尚不清楚。
, 百拇医药
4 结 论
从这些研究结果可以清楚地看到,成功地建立永生生殖细胞株和睾丸体细胞株可以进行一些用睾丸细胞原代培养非常困难或是不可能进行的实验。同时也应该清楚地看到,这个体外系统的其他应用存在局限性问题,尤其不清楚体外培养的不同类型细胞间,旁分泌信号通路功能整体性发挥到何种程度。通过将有功能的病毒癌基因SV40lt引入基因组,部分细胞株已具有了在体外永久传代的能力。但是,正如人们在GCispg细胞株中所见到的 ,这种转染能引起染色体畸变和非整倍体畸变。为了试图能调控活性lt抗原的水平,用lt抗原和温度敏感p53基因进行共转染,不朽化产生了其他细胞株。
但是 ,这种条件性不朽化未能超过2年。然而,一旦明白这些局限性,或是应用新的致不朽化方案,将能积极地利用这种体外培养系统。如果那样,可利用的睾丸细胞株将提供一个有力的实验手段,帮助研究者更快地知道精子发生过程中细胞水平和分子水平的调控机制。, http://www.100md.com(娄利霞 张亦清 贾孟春)
3.1 原理 为了试图调整sv40lt抗原的不朽化特性,以提高能在体外建立分化的生殖细胞株的可能性,实验者应用了p53结合lt抗原的特性。有人研究了Wtp53的过量表达对sv40转化启始和维持的抑制作用。发现小鼠Wtp53对于sv40lt抗原转化效应具有抑制和逆转功能。Wtp53在sv40转化过程中表现抑癌基因的功能,在转换期前细胞Wtp 53在转化起始和维持中都有抗转化功能。从而提出了关于p53 sv40lt抗原复合物在转化表型的诱导和维持中功能的假说。该假说认为这个复合物抑制了Wtp 53的功能,因此,导致了转化表型的表达。已有证据表明,当两种分子同时在转换期前的小鼠成纤维细胞中表达时,野生型p53蛋白的过量表达能消除lt抗原的增殖功能。温度敏感的p53蛋白,可在非允许温度39℃下失活 ,仍存在于突变的cDNA稳定转染的细胞胞质内。在允许温度37℃或32℃下,突变的温度敏感p53蛋白呈现野生型结构 ,并定位于细胞核内。因此 ,原代生殖细胞用lt抗原和温度敏感的p53共同转染而永生 ,因而可以推测:在39℃ ,lt抗原将使细胞发生不朽化 ,而温度敏感型p53蛋白将失活并局限于胞质内。如果不朽化细胞的培养温度转变为37℃或32℃ ,温度敏感型p53将具有活性结构 ,在细胞核内表现野生型的特性 ,抵消lt抗原的作用 ,使细胞继续分化。
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3.2 结果 Hofmann等人用这种方法转染富含细线前期精母细胞的生殖细胞群 ,建立了一个称为GC-2spd(ts)的生殖细胞株。在39℃下低密度培养,细胞呈现大的球形;当汇合时,细胞变成梭形。细胞贴附于组织培养皿快速生长,倍增时间为18h,并和预期的一样,p53蛋白仅在胞质中存在。在这个温度下,LDHC4和细胞色素酶同工酶分别呈现低的或不能被检测到的表达。在37℃下,细胞生长缓慢,倍增时间为24h。p53蛋白在细胞核和细胞质中都有表达,并且两种酶的表达增加。形态学特征表明,这些细胞具有早期精子细胞的特性。对37℃和39℃下培养的GC-2spd(ts)细胞的早期传代细胞(10代)的细胞计数分析 ,显示了存在二倍体和四倍体DNA含量,37℃下培养此细胞 85天以上,将出现第三个明显的单倍体高峰,并随时间而增长,直至细胞总数的28.4%(30代)。对有丝分裂细胞的染色体分析表明,GCWtp细胞单倍体期的染色体总数为20～21。在32℃下,细胞的增殖速度逐渐下降,在此温度下,平均10代以后细胞死亡。电镜分析证实,在32℃下GC-2spd(ts)细胞形成鞭毛轴,这进一步证实了这些细胞的部分群体具有早期精子细胞的特征。180bp的ldhc基因的启动子结构 ,在GC-2spd(ts)细胞中能有效地表达,但在体细胞中没有检测到这种表达,这与体内这种基因的表达一致。然而 ,在GC-2spd(ts)的体外长期培养中(大约2年),它们的分化能力并不能维持。这可能是由于长时间lt抗原所诱导的累积变化 ,抑制了细胞不朽化的逆转,正如其他体系中所表现的。温度敏感p53的整合并不是稳定到足以持续产生足够量的野生型蛋白,但这些变化的确切机制尚不清楚。
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4 结 论
从这些研究结果可以清楚地看到,成功地建立永生生殖细胞株和睾丸体细胞株可以进行一些用睾丸细胞原代培养非常困难或是不可能进行的实验。同时也应该清楚地看到,这个体外系统的其他应用存在局限性问题,尤其不清楚体外培养的不同类型细胞间,旁分泌信号通路功能整体性发挥到何种程度。通过将有功能的病毒癌基因SV40lt引入基因组,部分细胞株已具有了在体外永久传代的能力。但是,正如人们在GCispg细胞株中所见到的 ,这种转染能引起染色体畸变和非整倍体畸变。为了试图能调控活性lt抗原的水平,用lt抗原和温度敏感p53基因进行共转染,不朽化产生了其他细胞株。
但是 ,这种条件性不朽化未能超过2年。然而,一旦明白这些局限性,或是应用新的致不朽化方案,将能积极地利用这种体外培养系统。如果那样,可利用的睾丸细胞株将提供一个有力的实验手段,帮助研究者更快地知道精子发生过程中细胞水平和分子水平的调控机制。, http://www.100md.com(娄利霞 张亦清 贾孟春)