人睾丸前列腺素D合成酶重组表达质粒的构建与鉴定(2)
1.9 重组质粒的鉴定 用两种方法对重组质粒进行鉴定。一是PCR鉴定法:按 1.3的PCR扩增条件对提取质粒进行PCR扩增，看能否扩增出与插入的LPGDS cDNA片段大小一致的片段；为防止PCR的假阳性，又用双酶切鉴定法进一步鉴定，即提取质粒用BamHI和EcoRI进行酶切，用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.10 质粒DNA的提取和序列测定 用high pure plasmid isolation kit提取重组质粒DNA。序列测定由大连宝生物工程公司完成。
2 结果
2.1 编码htLPGDS的PCR扩增结果 见图 1。LPGDScDNA编码 190个氨基酸，编码区由 570bp组成。PCR扩增出了约 600bp的DNA片段，PCR产物与预期大小一致。
, http://www.100md.com
2.2 PGEX2T/htLPGDS重组表达质粒的构建 编码htLPGDS的DNA片段用BamHI和EcoRI双酶切，经纯化后连接到经同样的酶处理的PGEX2T载体中，构建成重组表达质粒PGEX2T/htLPGDS，转化大肠杆菌JM103 (图2)。
2.3 重组质粒的鉴定
2.3.1 PCR鉴定 选择培养得到的阳性菌提取质粒作为模板，再用primer1和primer2进行PCR扩增，得到约 600bp的特异性扩增条带(图3)。
2.3.2 酶切鉴定为了确证外源基因的存在，用BamHI和EcoRI对重组质粒进行双酶切鉴定，得到预期的DNA片段 (图3)。
, 百拇医药
我们共筛选阳性菌落109个，先用PCR鉴定出10个重组质粒，进一步用双酶切鉴定，证实 10个重组质粒皆插入了目的片段。后经序列测定证实，插入目的片段的核苷酸顺序与人睾丸LPGDS cDNA核苷酸顺序完全一致。
3 讨论
LPGDS广泛分布于全身各组织，其催化产物PGD2 不仅与睡眠调节，感受伤害，促性腺激素的释放及体温调节有关，亦与男性生殖密切相关。男性生殖系统表达LPGDS已被证实，但究竟何种细胞表达LPGDS文献报道并不一致，而且LPGDS表达的调控及作用机制及其在临床上的应用研究都存在大量空白点。用基因工程方法表达LPGDS，并籍此建立针对LPGDS的免疫学检测方法，对于促进LPGDS的基础和临床研究都是十分有意义的。考虑到免疫原分子量太小不能有效刺激抗体产生，甚至产生免疫耐受。本研究以htLPGDS与GST(谷胱甘肽S 转移酶)的融合蛋白形式表达，这样表达的融合蛋白分子比单纯的HTLPGDS多一段26KD的GST，有助于增强htLPGDS的免疫原性，同时，融合蛋白的GST部分便于用亲和层析纯化目的蛋白，融合蛋白用凝血酶作用又能使GST和htLPGDS分子分离，可获得纯的htv。因此，本研究选择了GST融合蛋白表达载体PGEX2T来构建重组表达质粒。
在重组质粒的构建过程中，本文采用了双酶切策略，这样可确保外源片段以正确的方向插入，而且避免了对酶切后的载体进行去磷酸化处理等麻烦。重组质粒的鉴定是确定目的基因是否正确插入，确保正确表达的关键。本研究采用了两种鉴定方法，PCR扩增得到了期望的约 600bp的条带，但PCR易出现假阳性结果，因此，接着用限制性内切酶对重组质粒进行了酶切鉴定，两者结果较一致。我们共筛选阳性菌落109个，先用PCR鉴定出 10个重组质粒，进一步用双酶切鉴定，证实 10个重组质粒皆插入了目的片段。
总之，重组表达质粒的构建及正确鉴定，为以后的重组抗原的表达、纯化及单克隆抗体的制备，为进一步进行男性生殖过程中LPGDS的基础和临床研究打下了基础。, 百拇医药(陆金春 黄宇烽 张锡然)
1.10 质粒DNA的提取和序列测定 用high pure plasmid isolation kit提取重组质粒DNA。序列测定由大连宝生物工程公司完成。
2 结果
2.1 编码htLPGDS的PCR扩增结果 见图 1。LPGDScDNA编码 190个氨基酸，编码区由 570bp组成。PCR扩增出了约 600bp的DNA片段，PCR产物与预期大小一致。
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2.2 PGEX2T/htLPGDS重组表达质粒的构建 编码htLPGDS的DNA片段用BamHI和EcoRI双酶切，经纯化后连接到经同样的酶处理的PGEX2T载体中，构建成重组表达质粒PGEX2T/htLPGDS，转化大肠杆菌JM103 (图2)。
2.3 重组质粒的鉴定
2.3.1 PCR鉴定 选择培养得到的阳性菌提取质粒作为模板，再用primer1和primer2进行PCR扩增，得到约 600bp的特异性扩增条带(图3)。
2.3.2 酶切鉴定为了确证外源基因的存在，用BamHI和EcoRI对重组质粒进行双酶切鉴定，得到预期的DNA片段 (图3)。
, 百拇医药
我们共筛选阳性菌落109个，先用PCR鉴定出10个重组质粒，进一步用双酶切鉴定，证实 10个重组质粒皆插入了目的片段。后经序列测定证实，插入目的片段的核苷酸顺序与人睾丸LPGDS cDNA核苷酸顺序完全一致。
3 讨论
LPGDS广泛分布于全身各组织，其催化产物PGD2 不仅与睡眠调节，感受伤害，促性腺激素的释放及体温调节有关，亦与男性生殖密切相关。男性生殖系统表达LPGDS已被证实，但究竟何种细胞表达LPGDS文献报道并不一致，而且LPGDS表达的调控及作用机制及其在临床上的应用研究都存在大量空白点。用基因工程方法表达LPGDS，并籍此建立针对LPGDS的免疫学检测方法，对于促进LPGDS的基础和临床研究都是十分有意义的。考虑到免疫原分子量太小不能有效刺激抗体产生，甚至产生免疫耐受。本研究以htLPGDS与GST(谷胱甘肽S 转移酶)的融合蛋白形式表达，这样表达的融合蛋白分子比单纯的HTLPGDS多一段26KD的GST，有助于增强htLPGDS的免疫原性，同时，融合蛋白的GST部分便于用亲和层析纯化目的蛋白，融合蛋白用凝血酶作用又能使GST和htLPGDS分子分离，可获得纯的htv。因此，本研究选择了GST融合蛋白表达载体PGEX2T来构建重组表达质粒。
在重组质粒的构建过程中，本文采用了双酶切策略，这样可确保外源片段以正确的方向插入，而且避免了对酶切后的载体进行去磷酸化处理等麻烦。重组质粒的鉴定是确定目的基因是否正确插入，确保正确表达的关键。本研究采用了两种鉴定方法，PCR扩增得到了期望的约 600bp的条带，但PCR易出现假阳性结果，因此，接着用限制性内切酶对重组质粒进行了酶切鉴定，两者结果较一致。我们共筛选阳性菌落109个，先用PCR鉴定出 10个重组质粒，进一步用双酶切鉴定，证实 10个重组质粒皆插入了目的片段。
总之，重组表达质粒的构建及正确鉴定，为以后的重组抗原的表达、纯化及单克隆抗体的制备，为进一步进行男性生殖过程中LPGDS的基础和临床研究打下了基础。, 百拇医药(陆金春 黄宇烽 张锡然)