定量PCR技术及在临床实验室应用的价值(1)
1.目前国内临床实验室应用PCR技术存在的问题：
在设施方面，如仪器显示的温度与孔内的温度不一致，有孔内差；自动化程度较低，人工操作人为误差较大；实验室布局不合理，不能满足3个分开的房间进行分阶段操作(第1间实验室为混合试剂和质控，第2间实验室为标本提取和试剂混合，第3间实验室为PCR扩增及产物检测，工作人员应从第1间依次到第3间实验室，不能返回工作。室内空气流向依次从第1间到第3间实验室，不能逆流，以防止空气污染；加样器及试剂等容易污染导致假阳性。另外，标本采集及保存不合适和操作不当易出现假阴性。例如检测痰中结核杆菌，标本采集一定是痰而不是唾液。血清中检测HCV-RNA标本保存不当，使病原体被破坏，或操作者不戴手套，对着试管讲话，唾液溅入标本，RNA降解，失去PCR的模板，造成假阴性结果。合理设计寡核苷酸序列，最好在保守区，特异性强，无干扰。
琼脂糖凝胶电泳鉴别PCR产物的影响因素较多。如模板量大则拖尾现象严重，非特异性干扰带多。结果难于清楚判断。标本中有抑制物(Hb,高浓度尿素)可出现假阴性。
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目前美国病理学会(CAP)等组织以及临床实验室改进修正案(CLIA 1988)要求正规检测方法是先行PCR扩增，然后进行杂交来判断结果。但美国一些实验室，如印第安纳大学医学中心的病理和医学实验室用PCR方法检测临床标本中HBV、EBV、CMV的DNA。他们认为在他们的实验室里，用琼脂糖凝胶电泳和电泳后再杂交的2种判断结果是一致的。因为他们实验室条件非常严格，而且每年都要通过美国CAP检查。但仍有些检测项目未得到美国FDA的批准。
2 .PCR技术检测的临床意义
我们认为对灵敏度和特异性基本上达到临床需要的检测技术，不必一律采用PCR技术。目前没有其他诊断技术可以检测的疾病，如基因缺失、易位、突变及病原体需要较长时间培养或培养难度较大的疾病应考虑用PCR方法。如人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种慢性病毒，在细胞内的繁殖水平比较低，感染后潜伏期较长，病毒难以培养而且需要较长时间培养。在对HIV抗原(HIV-Ag)和抗体(HIV-Ab)的检测结果难以判断时，可用PCR技术作为确认手段。当前临床标本一般仅检测HIV-Ab。在美国，血液制品既检测HIV-Ab也检测HIV-P24Ag 。国外有学者报道，感染HIV的患者血清HIV-P24Ag出现早于HIV-Ab10天左右。发现HIV-P24Ag(+)者，HIV PCR(+)。但HIV PCR(+)者，HIV- P24Ag可呈现(-)，此时患者已具有传染性。PCR技术可用于艾滋病的早期诊断，定量PCR技术还是艾滋病疗效观察的有效检测手段。
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用PCR和杂交方法对HCV基因分型、早期诊断和治疗监测均具有较大的临床意义，这已被国内外医学界的工作者公认。
结核分枝杆菌(MTB)培养时间一般要30-50天，培养出来的分枝杆菌还要鉴定是人型还是鸟型。涂片检查所需的抗酸杆菌也要一定的浓度。因此可以采用PCR方法检测。但PCR技术不能完全取代结核杆菌培养。PCR在药敏结果判断方面亦不理想。
当前有检测沙眼衣原体抗原的试剂盒，特异性高，但敏感性不甚满意。衣原体需在细胞中培养后进行鉴定，对临床常规检验工作有一定的难度。应用PCR技术检测沙眼衣原体有一定的临床意义。
美国FDA已批准HIV、MTB、沙眼衣原体的PCR或杂交检测试剂盒。也批准了HPV的过筛检测，对于HPV各型的检测，目前尚未批准。MTB的靶序列是16s DNA的584bp。其最后带用杂交检测。沙眼衣原体的检测试剂盒于1993年通过FDA批准，目前用特殊探针进行杂交后用免疫化学法检测。
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某些病毒(如CMV[2]、EBV等 )、细菌可在普通人体内存在，所以检测这些病毒、细菌最好用定量PCR，数量要达到一定程度才考虑有临床意义。国外文献报道，在严格的实验条件下，一些标本细菌培养结果和DNA结果不一致目前尚难以解释。但对有临床症状患者的标本某些细菌培养结果是阴性，mRNA的检测结果呈阳性，应考虑体内细菌致病[3]。
肿瘤基因检测对肿瘤生物学行为及生物学特性的了解和判断，对治疗及预后的评估均有效果。如前列腺癌组织KAI1基因表达高，则癌细胞的转移机率小。胚胎细胞P53抑癌基因突变的个体易患多种癌症。我们则应考虑如何发现这种具有胚细胞P53基因突变的个体，以期早期诊断及预防治疗。
3. 半定量和定量PCR及定量核酸的方法
(1)内对照法：
将已知的目的DNA及内对照DNA混合，加入两对引物同时进行PCR扩增，最后将PCR产物转膜，用特异性探针杂交，目的DNA扩增后的量通过系列稀释后与内对照的相对量进行比较即可确定。
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(2)PCR杂交法(PCR-Hyb法)
合成的引物5(端连有生物素，所带有生物素的PCR产物一端可与标有辣根过氧化物酶的亲合素结合。另一端与酶标板上包被的特异性探针杂交。然后加入底物显色，呈色的程度与PCR产物浓度呈正比。
(3)分枝DNA法(b-DNA法[1])
两种特异性探针与待测的RNA杂交，其中一种探针的另一端与酶标板上的探针杂交。另一种探针的另一端与分枝DNA杂交，分枝DNA的另一端再与放入的酶标记的探针杂交。最后放入化学发光底物，底物再酶的作用下，产生光的强度与待测DNA或RNA浓度呈正比。此方法有放大和定量的作用。
(4)PCR-杂交定量的荧光检测
PCR产物通过两个标有荧光团的探针进行杂交后，首先给第一个荧光团激发光，使它的发射光去激发第二个荧光团，荧光检测仪检测第二个荧光团发出的发射光来计算PCR产物。此方法的特异性很高。
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(5)连续荧光检测PCR产物
在进行PCR扩增的同时，荧光染料SYBPRGreen I结合到双链DNA产物上，在一定的温度下，连续监测荧光发射的最高峰，则可计算出PCR产物的量。
(6)5(核酸酶分析(荧光定量PCR)
探针的5(端标有荧光团，3(端标有淬灭团。荧光团与淬灭团在一定距离内，淬灭团控制荧光团的发光。此探针杂交在待测的DNA上，然后放大引物进行PCR扩增，当引物延伸到探针的5(端，切断探针5(端的荧光团，淬灭团失去控制荧光团的作用，则荧光团发出荧光。连续检测荧光的强度与待测的DNA浓度呈正比。
近10余年来PCR技术的发展将临床医学检验推动了一大步。此技术目前正在迅速发展，各种基因芯片也陆续研究出台，前景光明。但问题的关键是我们如何规范化临床PCR实验室、实验项目及实验仪器试剂。
, 百拇医药
近期可能要下发关于临床实验室的规范化管理和临床PCR实验室的规范化管理的条例。致使今后我们对临床实验室和PCR实验室的管理有法可依，有章可循。
参考文献
1. Gilliiand G,Perrin S,Blanchard K,et al. Analysis of cytokine mRNA And DNA: Detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1998,87:2725-2729
2. Storch GA,Ballei RS, Bailey TC,et al, Comparison of PCR and PP65 antigenemia assay with quantitation shell viral culture for detection of cytomegalovirus in blood leukocytes from solid organ transplant recipients. J Clin Microbiol, 1994,32(4) 997-1003
3. Rayner MG,Zhang y, Gorry MC. Evideence of bacterial metabolic activity in culture-negative otitis media with effusion.JAMA,1998,279(4):296, 百拇医药(张捷)
在设施方面，如仪器显示的温度与孔内的温度不一致，有孔内差；自动化程度较低，人工操作人为误差较大；实验室布局不合理，不能满足3个分开的房间进行分阶段操作(第1间实验室为混合试剂和质控，第2间实验室为标本提取和试剂混合，第3间实验室为PCR扩增及产物检测，工作人员应从第1间依次到第3间实验室，不能返回工作。室内空气流向依次从第1间到第3间实验室，不能逆流，以防止空气污染；加样器及试剂等容易污染导致假阳性。另外，标本采集及保存不合适和操作不当易出现假阴性。例如检测痰中结核杆菌，标本采集一定是痰而不是唾液。血清中检测HCV-RNA标本保存不当，使病原体被破坏，或操作者不戴手套，对着试管讲话，唾液溅入标本，RNA降解，失去PCR的模板，造成假阴性结果。合理设计寡核苷酸序列，最好在保守区，特异性强，无干扰。
琼脂糖凝胶电泳鉴别PCR产物的影响因素较多。如模板量大则拖尾现象严重，非特异性干扰带多。结果难于清楚判断。标本中有抑制物(Hb,高浓度尿素)可出现假阴性。
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目前美国病理学会(CAP)等组织以及临床实验室改进修正案(CLIA 1988)要求正规检测方法是先行PCR扩增，然后进行杂交来判断结果。但美国一些实验室，如印第安纳大学医学中心的病理和医学实验室用PCR方法检测临床标本中HBV、EBV、CMV的DNA。他们认为在他们的实验室里，用琼脂糖凝胶电泳和电泳后再杂交的2种判断结果是一致的。因为他们实验室条件非常严格，而且每年都要通过美国CAP检查。但仍有些检测项目未得到美国FDA的批准。
2 .PCR技术检测的临床意义
我们认为对灵敏度和特异性基本上达到临床需要的检测技术，不必一律采用PCR技术。目前没有其他诊断技术可以检测的疾病，如基因缺失、易位、突变及病原体需要较长时间培养或培养难度较大的疾病应考虑用PCR方法。如人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种慢性病毒，在细胞内的繁殖水平比较低，感染后潜伏期较长，病毒难以培养而且需要较长时间培养。在对HIV抗原(HIV-Ag)和抗体(HIV-Ab)的检测结果难以判断时，可用PCR技术作为确认手段。当前临床标本一般仅检测HIV-Ab。在美国，血液制品既检测HIV-Ab也检测HIV-P24Ag 。国外有学者报道，感染HIV的患者血清HIV-P24Ag出现早于HIV-Ab10天左右。发现HIV-P24Ag(+)者，HIV PCR(+)。但HIV PCR(+)者，HIV- P24Ag可呈现(-)，此时患者已具有传染性。PCR技术可用于艾滋病的早期诊断，定量PCR技术还是艾滋病疗效观察的有效检测手段。
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用PCR和杂交方法对HCV基因分型、早期诊断和治疗监测均具有较大的临床意义，这已被国内外医学界的工作者公认。
结核分枝杆菌(MTB)培养时间一般要30-50天，培养出来的分枝杆菌还要鉴定是人型还是鸟型。涂片检查所需的抗酸杆菌也要一定的浓度。因此可以采用PCR方法检测。但PCR技术不能完全取代结核杆菌培养。PCR在药敏结果判断方面亦不理想。
当前有检测沙眼衣原体抗原的试剂盒，特异性高，但敏感性不甚满意。衣原体需在细胞中培养后进行鉴定，对临床常规检验工作有一定的难度。应用PCR技术检测沙眼衣原体有一定的临床意义。
美国FDA已批准HIV、MTB、沙眼衣原体的PCR或杂交检测试剂盒。也批准了HPV的过筛检测，对于HPV各型的检测，目前尚未批准。MTB的靶序列是16s DNA的584bp。其最后带用杂交检测。沙眼衣原体的检测试剂盒于1993年通过FDA批准，目前用特殊探针进行杂交后用免疫化学法检测。
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某些病毒(如CMV[2]、EBV等 )、细菌可在普通人体内存在，所以检测这些病毒、细菌最好用定量PCR，数量要达到一定程度才考虑有临床意义。国外文献报道，在严格的实验条件下，一些标本细菌培养结果和DNA结果不一致目前尚难以解释。但对有临床症状患者的标本某些细菌培养结果是阴性，mRNA的检测结果呈阳性，应考虑体内细菌致病[3]。
肿瘤基因检测对肿瘤生物学行为及生物学特性的了解和判断，对治疗及预后的评估均有效果。如前列腺癌组织KAI1基因表达高，则癌细胞的转移机率小。胚胎细胞P53抑癌基因突变的个体易患多种癌症。我们则应考虑如何发现这种具有胚细胞P53基因突变的个体，以期早期诊断及预防治疗。
3. 半定量和定量PCR及定量核酸的方法
(1)内对照法：
将已知的目的DNA及内对照DNA混合，加入两对引物同时进行PCR扩增，最后将PCR产物转膜，用特异性探针杂交，目的DNA扩增后的量通过系列稀释后与内对照的相对量进行比较即可确定。
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(2)PCR杂交法(PCR-Hyb法)
合成的引物5(端连有生物素，所带有生物素的PCR产物一端可与标有辣根过氧化物酶的亲合素结合。另一端与酶标板上包被的特异性探针杂交。然后加入底物显色，呈色的程度与PCR产物浓度呈正比。
(3)分枝DNA法(b-DNA法[1])
两种特异性探针与待测的RNA杂交，其中一种探针的另一端与酶标板上的探针杂交。另一种探针的另一端与分枝DNA杂交，分枝DNA的另一端再与放入的酶标记的探针杂交。最后放入化学发光底物，底物再酶的作用下，产生光的强度与待测DNA或RNA浓度呈正比。此方法有放大和定量的作用。
(4)PCR-杂交定量的荧光检测
PCR产物通过两个标有荧光团的探针进行杂交后，首先给第一个荧光团激发光，使它的发射光去激发第二个荧光团，荧光检测仪检测第二个荧光团发出的发射光来计算PCR产物。此方法的特异性很高。
, http://www.100md.com
(5)连续荧光检测PCR产物
在进行PCR扩增的同时，荧光染料SYBPRGreen I结合到双链DNA产物上，在一定的温度下，连续监测荧光发射的最高峰，则可计算出PCR产物的量。
(6)5(核酸酶分析(荧光定量PCR)
探针的5(端标有荧光团，3(端标有淬灭团。荧光团与淬灭团在一定距离内，淬灭团控制荧光团的发光。此探针杂交在待测的DNA上，然后放大引物进行PCR扩增，当引物延伸到探针的5(端，切断探针5(端的荧光团，淬灭团失去控制荧光团的作用，则荧光团发出荧光。连续检测荧光的强度与待测的DNA浓度呈正比。
近10余年来PCR技术的发展将临床医学检验推动了一大步。此技术目前正在迅速发展，各种基因芯片也陆续研究出台，前景光明。但问题的关键是我们如何规范化临床PCR实验室、实验项目及实验仪器试剂。
, 百拇医药
近期可能要下发关于临床实验室的规范化管理和临床PCR实验室的规范化管理的条例。致使今后我们对临床实验室和PCR实验室的管理有法可依，有章可循。
参考文献
1. Gilliiand G,Perrin S,Blanchard K,et al. Analysis of cytokine mRNA And DNA: Detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1998,87:2725-2729
2. Storch GA,Ballei RS, Bailey TC,et al, Comparison of PCR and PP65 antigenemia assay with quantitation shell viral culture for detection of cytomegalovirus in blood leukocytes from solid organ transplant recipients. J Clin Microbiol, 1994,32(4) 997-1003
3. Rayner MG,Zhang y, Gorry MC. Evideence of bacterial metabolic activity in culture-negative otitis media with effusion.JAMA,1998,279(4):296, 百拇医药(张捷)
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