定量PCR技术及在临床实验室应用的价值(2)
美国FDA已批准HIV、MTB、沙眼衣原体的PCR或杂交检测试剂盒。也批准了HPV的过筛检测，对于HPV各型的检测，目前尚未批准。MTB的靶序列是16s DNA的584bp。其最后带用杂交检测。沙眼衣原体的检测试剂盒于1993年通过FDA批准，目前用特殊探针进行杂交后用免疫化学法检测。
某些病毒(如CMV[2]、EBV等 )、细菌可在普通人体内存在，所以检测这些病毒、细菌最好用定量PCR，数量要达到一定程度才考虑有临床意义。国外文献报道，在严格的实验条件下，一些标本细菌培养结果和DNA结果不一致目前尚难以解释。但对有临床症状患者的标本某些细菌培养结果是阴性，mRNA的检测结果呈阳性，应考虑体内细菌致病[3]。
肿瘤基因检测对肿瘤生物学行为及生物学特性的了解和判断，对治疗及预后的评估均有效果。如前列腺癌组织KAI1基因表达高，则癌细胞的转移机率小。胚胎细胞P53抑癌基因突变的个体易患多种癌症。我们则应考虑如何发现这种具有胚细胞P53基因突变的个体，以期早期诊断及预防治疗。
, 百拇医药
3. 半定量和定量PCR及定量核酸的方法
(1)内对照法：
将已知的目的DNA及内对照DNA混合，加入两对引物同时进行PCR扩增，最后将PCR产物转膜，用特异性探针杂交，目的DNA扩增后的量通过系列稀释后与内对照的相对量进行比较即可确定。
(2)PCR杂交法(PCR-Hyb法)
合成的引物5'端连有生物素，所带有生物素的PCR产物一端可与标有辣根过氧化物酶的亲合素结合。另一端与酶标板上包被的特异性探针杂交。然后加入底物显色，呈色的程度与PCR产物浓度呈正比。
(3)分枝DNA法(b-DNA法[1])
两种特异性探针与待测的RNA杂交，其中一种探针的另一端与酶标板上的探针杂交。另一种探针的另一端与分枝DNA杂交，分枝DNA的另一端再与放入的酶标记的探针杂交。最后放入化学发光底物，底物再酶的作用下，产生光的强度与待测DNA或RNA浓度呈正比。此方法有放大和定量的作用。
, 百拇医药
(4)PCR-杂交定量的荧光检测
PCR产物通过两个标有荧光团的探针进行杂交后，首先给第一个荧光团激发光，使它的发射光去激发第二个荧光团，荧光检测仪检测第二个荧光团发出的发射光来计算PCR产物。此方法的特异性很高。
(5)连续荧光检测PCR产物
在进行PCR扩增的同时，荧光染料SYBPRGreen I结合到双链DNA产物上，在一定的温度下，连续监测荧光发射的最高峰，则可计算出PCR产物的量。
(6)5'核酸酶分析(荧光定量PCR)
探针的5'端标有荧光团，3'端标有淬灭团。荧光团与淬灭团在一定距离内，淬灭团控制荧光团的发光。此探针杂交在待测的DNA上，然后放大引物进行PCR扩增，当引物延伸到探针的5'端，切断探针5'端的荧光团，淬灭团失去控制荧光团的作用，则荧光团发出荧光。连续检测荧光的强度与待测的DNA浓度呈正比。
, http://www.100md.com
近10余年来PCR技术的发展将临床医学检验推动了一大步。此技术目前正在迅速发展，各种基因芯片也陆续研究出台，前景光明。但问题的关键是我们如何规范化临床PCR实验室、实验项目及实验仪器试剂。
近期可能要下发关于临床实验室的规范化管理和临床PCR实验室的规范化管理的条例。致使今后我们对临床实验室和PCR实验室的管理有法可依，有章可循。
参考文献
1. Gilliiand G,Perrin S,Blanchard K,et al. Analysis of cytokine mRNA And DNA: Detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1998,87:2725-2729
2. Storch GA,Ballei RS, Bailey TC,et al, Comparison of PCR and PP65 antigenemia assay with quantitation shell viral culture for detection of cytomegalovirus in blood leukocytes from solid organ transplant recipients. J Clin Microbiol, 1994,32(4) 997-1003
3. Rayner MG,Zhang y, Gorry MC. Evideence of bacterial metabolic activity in culture-negative otitis media with effusion.JAMA,1998,279(4):296, 百拇医药(张捷)
某些病毒(如CMV[2]、EBV等 )、细菌可在普通人体内存在，所以检测这些病毒、细菌最好用定量PCR，数量要达到一定程度才考虑有临床意义。国外文献报道，在严格的实验条件下，一些标本细菌培养结果和DNA结果不一致目前尚难以解释。但对有临床症状患者的标本某些细菌培养结果是阴性，mRNA的检测结果呈阳性，应考虑体内细菌致病[3]。
肿瘤基因检测对肿瘤生物学行为及生物学特性的了解和判断，对治疗及预后的评估均有效果。如前列腺癌组织KAI1基因表达高，则癌细胞的转移机率小。胚胎细胞P53抑癌基因突变的个体易患多种癌症。我们则应考虑如何发现这种具有胚细胞P53基因突变的个体，以期早期诊断及预防治疗。
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3. 半定量和定量PCR及定量核酸的方法
(1)内对照法：
将已知的目的DNA及内对照DNA混合，加入两对引物同时进行PCR扩增，最后将PCR产物转膜，用特异性探针杂交，目的DNA扩增后的量通过系列稀释后与内对照的相对量进行比较即可确定。
(2)PCR杂交法(PCR-Hyb法)
合成的引物5'端连有生物素，所带有生物素的PCR产物一端可与标有辣根过氧化物酶的亲合素结合。另一端与酶标板上包被的特异性探针杂交。然后加入底物显色，呈色的程度与PCR产物浓度呈正比。
(3)分枝DNA法(b-DNA法[1])
两种特异性探针与待测的RNA杂交，其中一种探针的另一端与酶标板上的探针杂交。另一种探针的另一端与分枝DNA杂交，分枝DNA的另一端再与放入的酶标记的探针杂交。最后放入化学发光底物，底物再酶的作用下，产生光的强度与待测DNA或RNA浓度呈正比。此方法有放大和定量的作用。
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(4)PCR-杂交定量的荧光检测
PCR产物通过两个标有荧光团的探针进行杂交后，首先给第一个荧光团激发光，使它的发射光去激发第二个荧光团，荧光检测仪检测第二个荧光团发出的发射光来计算PCR产物。此方法的特异性很高。
(5)连续荧光检测PCR产物
在进行PCR扩增的同时，荧光染料SYBPRGreen I结合到双链DNA产物上，在一定的温度下，连续监测荧光发射的最高峰，则可计算出PCR产物的量。
(6)5'核酸酶分析(荧光定量PCR)
探针的5'端标有荧光团，3'端标有淬灭团。荧光团与淬灭团在一定距离内，淬灭团控制荧光团的发光。此探针杂交在待测的DNA上，然后放大引物进行PCR扩增，当引物延伸到探针的5'端，切断探针5'端的荧光团，淬灭团失去控制荧光团的作用，则荧光团发出荧光。连续检测荧光的强度与待测的DNA浓度呈正比。
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近10余年来PCR技术的发展将临床医学检验推动了一大步。此技术目前正在迅速发展，各种基因芯片也陆续研究出台，前景光明。但问题的关键是我们如何规范化临床PCR实验室、实验项目及实验仪器试剂。
近期可能要下发关于临床实验室的规范化管理和临床PCR实验室的规范化管理的条例。致使今后我们对临床实验室和PCR实验室的管理有法可依，有章可循。
参考文献
1. Gilliiand G,Perrin S,Blanchard K,et al. Analysis of cytokine mRNA And DNA: Detection and quantitation by competitive polymerase chain reaction.Proc Natl Acad Sci USA,1998,87:2725-2729
2. Storch GA,Ballei RS, Bailey TC,et al, Comparison of PCR and PP65 antigenemia assay with quantitation shell viral culture for detection of cytomegalovirus in blood leukocytes from solid organ transplant recipients. J Clin Microbiol, 1994,32(4) 997-1003
3. Rayner MG,Zhang y, Gorry MC. Evideence of bacterial metabolic activity in culture-negative otitis media with effusion.JAMA,1998,279(4):296, 百拇医药(张捷)