标本处理对聚合酶链反应测定乙肝病毒核酸的影响(1)
乙型肝炎病毒(HBV)DNA的定量测定在乙型肝炎病人的临床治疗监测中有重要参考价值,其前提是定量必须具有很好的重复性。目前国内用于HBV DNA定量测定的方法基本上是荧光定量聚合酶链反应(PCR,TaqMan)技术,这种实时测定技术方便简单,且不易引起污染。影响PCR测定重复性和准确性的因素,除了PCR扩增本身以外,还有一个常被忽略但也非常关键的因素,即标本处理。目前,国内绝大部分用于HBV DNA测定的PCR试剂盒,常采用直接对血清煮沸裂解以释放病毒核酸的方法处理标本,这种方法虽然较经典的核酸提取方法简便,但由于其只是简单地将核酸从病毒颗粒中释放出来,继而用于扩增检测,血清中的一些成分,如血红素可能会对扩增产生抑制作用,从而影响测定。为此,我们比较了核酸提取纯化与煮沸裂解法对HBV DNA荧光定量测定的准确性和重复性的影响,结果报告如下。
材料和方法
一.材料
1 试剂:HBV DNA荧光定量PCR试剂盒由深圳匹基生物技术开发有限公司提供。核酸纯化试剂来自于美国Biotronics公司。
2 仪器:PE5700荧光定量PCR仪(PE,美国)。
二、方法
1.血清标本处理。煮沸裂解法即采用现常用的试剂盒方法,操作简述如下:50μk血清中加入等体积裂解液,煮沸10min,离心后取上清直接用于PCR扩增。核酸纯化方法按试剂说明操作,简述如下:于1.5ml离心管中加入120μl血清或血浆和200μl STG溶液,充分混匀,80℃10min。15000g离心5min,然后用异丙醇沉淀,KW试剂洗涤,干后备用。该方法较酚-氯仿核酸纯化方法简便易行。
2.标本处理方法对测定的重复性的影响。取1份HBV DNA含量较高样本,原样及用阴性人血清稀释100倍后,分别用上述两种样本处理方法各提取15次,然后进行荧光定量测定,比较两种不同方法的测定重复性。
3. 血红蛋白干扰试验。取枸橼酸盐抗凝的正常人血,用生理盐水冼涤数次后,加入一定量无菌蒸馏水溶解红细胞,测定血红蛋白含量。取一定量加入至HBV DNA较高含量样本中,至血红蛋白终浓度分别为589μg/L、58.9μg/L和5.89μg/L。然后再对这HBV DNA含量相同,但血红蛋白含量不同的3份样本分别用上述2种样本处理方法双份提取,荧光定量测定HBV DNA,比较结果。
4 统计学分析。血红蛋白含量不同对2种标本处理方法所得测定结果的差异采用t检验。
三.结果
1.对HBV DNA定量测定重复性的影响从表1可见,核酸纯化方法处理标本所得到的测定结果,重复性明显好于煮沸裂解法。同时核酸纯化方法所得的结果,较好地反映出了2个样本之间1∶100稀释的倍比关系。
, 百拇医药(李金明 王露楠 邓巍)
材料和方法
一.材料
1 试剂:HBV DNA荧光定量PCR试剂盒由深圳匹基生物技术开发有限公司提供。核酸纯化试剂来自于美国Biotronics公司。
2 仪器:PE5700荧光定量PCR仪(PE,美国)。
二、方法
1.血清标本处理。煮沸裂解法即采用现常用的试剂盒方法,操作简述如下:50μk血清中加入等体积裂解液,煮沸10min,离心后取上清直接用于PCR扩增。核酸纯化方法按试剂说明操作,简述如下:于1.5ml离心管中加入120μl血清或血浆和200μl STG溶液,充分混匀,80℃10min。15000g离心5min,然后用异丙醇沉淀,KW试剂洗涤,干后备用。该方法较酚-氯仿核酸纯化方法简便易行。
2.标本处理方法对测定的重复性的影响。取1份HBV DNA含量较高样本,原样及用阴性人血清稀释100倍后,分别用上述两种样本处理方法各提取15次,然后进行荧光定量测定,比较两种不同方法的测定重复性。
3. 血红蛋白干扰试验。取枸橼酸盐抗凝的正常人血,用生理盐水冼涤数次后,加入一定量无菌蒸馏水溶解红细胞,测定血红蛋白含量。取一定量加入至HBV DNA较高含量样本中,至血红蛋白终浓度分别为589μg/L、58.9μg/L和5.89μg/L。然后再对这HBV DNA含量相同,但血红蛋白含量不同的3份样本分别用上述2种样本处理方法双份提取,荧光定量测定HBV DNA,比较结果。
4 统计学分析。血红蛋白含量不同对2种标本处理方法所得测定结果的差异采用t检验。
三.结果
1.对HBV DNA定量测定重复性的影响从表1可见,核酸纯化方法处理标本所得到的测定结果,重复性明显好于煮沸裂解法。同时核酸纯化方法所得的结果,较好地反映出了2个样本之间1∶100稀释的倍比关系。
, 百拇医药(李金明 王露楠 邓巍)