尿脱落细胞ras癌基因突变的检测(4)
讨论
当PCR产物小于200bp时,SSCP分析能检测70%～95%的点突变,其敏感性随PCR产物长度的增加而降低,所以,我们通过针对ras的癌基因突变热点来扩增较短的DNA片段,以提高检出率,同时我们还对SSCP的实验参数(如凝胶浓度,电压,电泳恒温,变性剂成分及浓度)作了一系列的优化,来消除假阳性。由于尿脱落细胞中可能会混杂正常组织来源的细胞,在SSCP和测序时会同时出现正常或异常条带,影响结果的判断。为此,我们经SSCP发现异常条带后,先从聚丙烯酰胺胶上割下含异常条带的凝胶,回收后再次扩增,再纯化回收扩增产物后测序,使测序模板尽可能多地含有变异的DNA片断,以尽可能减少测序时的条带,并提高检测的阳性率和准确性。
本研究的阳性检出率48%(23/48)与JAmes等[2]的结果相近(44%,44/100)。分析可能由于ras癌基因点突变的肿瘤细胞在肿瘤组织只占少部分,在肿瘤组织检查中易于漏检。国内学者在包埋组织标本、手术标本中有62%、36%的不同检出率的报道,这种差异可能由于检查的例数差异、临床病理资料差异所致,也可能是检查方法上存在一定的假阳性,因其对可能的基因突变尚缺乏DNA测序来鉴定[3,4]。
在本研究中,我们注意到,ras的癌基因1外显子这个肿瘤标记物对TCC的检出率(48%)要显著高于脱落细胞学检查(15%),尤其在高分化的TCC标记中,SSCP法对人ras癌基因的检出率(50%)要大大高于脱落细胞学检查(6%),但脱落细胞学检查对低分化的TCC的检出率较高。有研究表明,脱落细胞学检查对TCC原位癌诊断有特别的意义,在12例原位癌的TCC标本中发现9例阳性。我们结合临床分析,发现该基因突变与临床分期呈明显正相关,T2 T4期基因突变率明显高于Tis T1期(P<0.05),而且复发组突变率明显高于原发组(P<0.01)。这说明该基因突变可能在膀胱癌发生、发展过程中较为重要,有望作为判断肿瘤恶性程度、进展及预后的一个监测性的肿瘤标志物应用于临床。
TCC的发生发展及预后是涉及多基因多步骤的复杂事件,对其诊断仅依赖于一项肿瘤标志,显然是不够现实。多选择几个临床可行的肿瘤标志物,多参数、多层面地提高对TCC的检出率,应是今后该领域的研究方向。如对TCC患者同时做尿脱落细胞端粒酶活性和脱落细胞学检查,则可使TCC早期率较单纯脱落细胞学检查提高5.6倍[5]。, 百拇医药(何晓文 李峻 靳小青 卢建 马小兵 孙民 钮燕 陆翠琴)
当PCR产物小于200bp时,SSCP分析能检测70%～95%的点突变,其敏感性随PCR产物长度的增加而降低,所以,我们通过针对ras的癌基因突变热点来扩增较短的DNA片段,以提高检出率,同时我们还对SSCP的实验参数(如凝胶浓度,电压,电泳恒温,变性剂成分及浓度)作了一系列的优化,来消除假阳性。由于尿脱落细胞中可能会混杂正常组织来源的细胞,在SSCP和测序时会同时出现正常或异常条带,影响结果的判断。为此,我们经SSCP发现异常条带后,先从聚丙烯酰胺胶上割下含异常条带的凝胶,回收后再次扩增,再纯化回收扩增产物后测序,使测序模板尽可能多地含有变异的DNA片断,以尽可能减少测序时的条带,并提高检测的阳性率和准确性。
本研究的阳性检出率48%(23/48)与JAmes等[2]的结果相近(44%,44/100)。分析可能由于ras癌基因点突变的肿瘤细胞在肿瘤组织只占少部分,在肿瘤组织检查中易于漏检。国内学者在包埋组织标本、手术标本中有62%、36%的不同检出率的报道,这种差异可能由于检查的例数差异、临床病理资料差异所致,也可能是检查方法上存在一定的假阳性,因其对可能的基因突变尚缺乏DNA测序来鉴定[3,4]。
在本研究中,我们注意到,ras的癌基因1外显子这个肿瘤标记物对TCC的检出率(48%)要显著高于脱落细胞学检查(15%),尤其在高分化的TCC标记中,SSCP法对人ras癌基因的检出率(50%)要大大高于脱落细胞学检查(6%),但脱落细胞学检查对低分化的TCC的检出率较高。有研究表明,脱落细胞学检查对TCC原位癌诊断有特别的意义,在12例原位癌的TCC标本中发现9例阳性。我们结合临床分析,发现该基因突变与临床分期呈明显正相关,T2 T4期基因突变率明显高于Tis T1期(P<0.05),而且复发组突变率明显高于原发组(P<0.01)。这说明该基因突变可能在膀胱癌发生、发展过程中较为重要,有望作为判断肿瘤恶性程度、进展及预后的一个监测性的肿瘤标志物应用于临床。
TCC的发生发展及预后是涉及多基因多步骤的复杂事件,对其诊断仅依赖于一项肿瘤标志,显然是不够现实。多选择几个临床可行的肿瘤标志物,多参数、多层面地提高对TCC的检出率,应是今后该领域的研究方向。如对TCC患者同时做尿脱落细胞端粒酶活性和脱落细胞学检查,则可使TCC早期率较单纯脱落细胞学检查提高5.6倍[5]。, 百拇医药(何晓文 李峻 靳小青 卢建 马小兵 孙民 钮燕 陆翠琴)