我国神经药理学研究的主要进展(下)(2)
4.细胞内钙的测定 胞内游离钙具有重要的生理功能，了解其含量和变化，具有多方面意义，无论是细胞外信号或是细胞内调节物，不论是电的，机械的或化学的刺激，凡能引起胞内Ca2+浓度的变化，那么由Ca2+介导的或依赖于钙的酶、蛋白质和有关的生理生化反应也发生改变，因此，细胞内游离钙的变化，代表着某种细胞功能启动、加强或抑制。通过提高或抑制细胞内的钙水平来观察相应生理应答反应的变化，有助于了解Ca2+对正常生理反应的调节过程。有些疾病的发生、发展往往是由于细胞内钙离子超负荷所致。测定细胞内Ca2+，可提供它与疾病间关联的直接证据。另外，胞内钙测定有助于阐明药物作用机制。
测定细胞内游离钙含量的方法甚多，近年内荧光指示剂特别是Fura-2已得到最广泛的应用，中国医学科学院药物研究所最先在国内合成成功，并对神经元、淋巴细胞、血小板等多种细胞的测定方法进行了详细研究，举行多次学习班向全国推广。其主要优点是Fura-2与钙结合后有较大的荧光强度(比Quin-2强30倍)。它用于测定胞内钙的浓度范围介于10-4—10-10mol·L -1，包括了细胞处于静止期、激活或损伤时的钙浓度的变化。Fura-2因有较强的亲水性，难以进入细胞，在Fura-2的负性基团部位结合亲脂的乙酰羟甲基脂，成为Fura-2/AM后则极易透过细胞膜，胞浆内的酯酶将Fura-2/AM水解为Fura-2而滞留在胞浆内，后者与胞浆内游离钙结合形成Fura-2 Ca2+复合物，Fura-2 及其与Ca2+结合的复合物最大激发波长为380nm和340nm，其发射强度与Ca2+呈比例关系，据此可测定Ca2+浓度。
, http://www.100md.com
近几年来国内采用激光扫描共聚焦显微系统和Fluo-3/AM荧光探剂标记技术观察单细胞内游离钙浓度的动态变化与分布影像，已相当成熟。主要是取清洁级孕鼠，剖腹取出胎鼠，分离皮层细胞，进行培养，于12-14天时用Fluo-3/AM负载，Fluo-3/AM在细胞内被酯酶水解成Fluo-3，Fluo-3与细胞内游离钙结合后荧光强度增强，指示[Ca2+]i的相应改变，倒置显微镜20X物镜下动态观察单细胞[Ca2+]i变化，在Time Series程序下开始预扫描，调节扫描参数，以取得最大电信号，最小光漂白度和最好信噪比，参数确定后动态扫描，采及格数据的间隔时间为15s，高速微机逐幅贮存观察到的动态荧光图像，并绘制细胞内Ca2+荧光强度变化曲线。
5.仪器分析在药理研究中的应用 仪器分析已渐为药理学工作者采用，特别是高压液相色谱(HPLC)、气相-质谱(GC-MS)和核磁共振谱(NMR)的药理学研究中的应用前景宽广。HPLC与电化学检测器联用，除可用于分析测定生物样品的NE、DA、5-HT及其代谢产物(已如上述)，用此装置还可测定氧和羟基自由基，特别是对后者的测定优于ESR法。GC-MS和 HPLC联用，具有高分离效率、高灵敏度和测定药物、毒物种类广泛等优点。目前对运动员禁用的“兴奋剂”包括5大类(兴奋剂、同化类固醇、利尿剂、β-受体阻断剂和麻醉药)100种药物及其代谢产物的测定，即可用GC-MS、毛细管气相色谱等检测手段来完成。NMR不但用于化学结构测定，也在生物医学中得到广泛应用。例如利用NMR观测药物与大分子(蛋白质、酶、受体)的相互作用引起双方构象或动态的变化，从谱峰的变化可反应药物代谢变化药物与分子结合的量、速度和结合方式。再如观测药物与磷脂、生物膜结构与功能关系，直接观测生物体内磷酸肌酸、ATP、糖磷和无机磷浓度，从而了解高能化合物的合成、分解过程。现已可用NMR观测的组织器官有：心脏、脑、肌肉、肝等。这一测定技术优点是，不破坏样品，不伤害生物组织，结果接近生理状态，获取信息量大，可测定生物体中所含的多种主要元素(1H、13C、15N、31P、19F、23N等)，从原子、基因、分子到生物结构系统提示不同层次的相互关系。, 百拇医药(张均田)
测定细胞内游离钙含量的方法甚多，近年内荧光指示剂特别是Fura-2已得到最广泛的应用，中国医学科学院药物研究所最先在国内合成成功，并对神经元、淋巴细胞、血小板等多种细胞的测定方法进行了详细研究，举行多次学习班向全国推广。其主要优点是Fura-2与钙结合后有较大的荧光强度(比Quin-2强30倍)。它用于测定胞内钙的浓度范围介于10-4—10-10mol·L -1，包括了细胞处于静止期、激活或损伤时的钙浓度的变化。Fura-2因有较强的亲水性，难以进入细胞，在Fura-2的负性基团部位结合亲脂的乙酰羟甲基脂，成为Fura-2/AM后则极易透过细胞膜，胞浆内的酯酶将Fura-2/AM水解为Fura-2而滞留在胞浆内，后者与胞浆内游离钙结合形成Fura-2 Ca2+复合物，Fura-2 及其与Ca2+结合的复合物最大激发波长为380nm和340nm，其发射强度与Ca2+呈比例关系，据此可测定Ca2+浓度。
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近几年来国内采用激光扫描共聚焦显微系统和Fluo-3/AM荧光探剂标记技术观察单细胞内游离钙浓度的动态变化与分布影像，已相当成熟。主要是取清洁级孕鼠，剖腹取出胎鼠，分离皮层细胞，进行培养，于12-14天时用Fluo-3/AM负载，Fluo-3/AM在细胞内被酯酶水解成Fluo-3，Fluo-3与细胞内游离钙结合后荧光强度增强，指示[Ca2+]i的相应改变，倒置显微镜20X物镜下动态观察单细胞[Ca2+]i变化，在Time Series程序下开始预扫描，调节扫描参数，以取得最大电信号，最小光漂白度和最好信噪比，参数确定后动态扫描，采及格数据的间隔时间为15s，高速微机逐幅贮存观察到的动态荧光图像，并绘制细胞内Ca2+荧光强度变化曲线。
5.仪器分析在药理研究中的应用 仪器分析已渐为药理学工作者采用，特别是高压液相色谱(HPLC)、气相-质谱(GC-MS)和核磁共振谱(NMR)的药理学研究中的应用前景宽广。HPLC与电化学检测器联用，除可用于分析测定生物样品的NE、DA、5-HT及其代谢产物(已如上述)，用此装置还可测定氧和羟基自由基，特别是对后者的测定优于ESR法。GC-MS和 HPLC联用，具有高分离效率、高灵敏度和测定药物、毒物种类广泛等优点。目前对运动员禁用的“兴奋剂”包括5大类(兴奋剂、同化类固醇、利尿剂、β-受体阻断剂和麻醉药)100种药物及其代谢产物的测定，即可用GC-MS、毛细管气相色谱等检测手段来完成。NMR不但用于化学结构测定，也在生物医学中得到广泛应用。例如利用NMR观测药物与大分子(蛋白质、酶、受体)的相互作用引起双方构象或动态的变化，从谱峰的变化可反应药物代谢变化药物与分子结合的量、速度和结合方式。再如观测药物与磷脂、生物膜结构与功能关系，直接观测生物体内磷酸肌酸、ATP、糖磷和无机磷浓度，从而了解高能化合物的合成、分解过程。现已可用NMR观测的组织器官有：心脏、脑、肌肉、肝等。这一测定技术优点是，不破坏样品，不伤害生物组织，结果接近生理状态，获取信息量大，可测定生物体中所含的多种主要元素(1H、13C、15N、31P、19F、23N等)，从原子、基因、分子到生物结构系统提示不同层次的相互关系。, 百拇医药(张均田)