脑能量代谢与相关疾病(下)(2)
2.线粒体呼吸功能测定 氧代谢测定法是测定线粒体呼吸功能的常用方法。该方法是在密闭系统中，观察线粒体在不同的反应条件下对氧消耗的能力。由于线粒体的全部生化反应过程均与氧的代谢密切相关，氧代谢的量和氧代谢的速率可以显示线粒体的基本代谢状态在提取和制备过程中会发生变化，实验中必须严格控制条件并设定严格的对照。
采用Clark氧电极进行测定，反应槽体积为2ml，反应温度控制在30℃。用连二亚硫酸钠测定100%氧含量。将新鲜制备的线粒体蛋白0.5-1.0mg/ml加入到呼吸反应缓冲液内(150 mM sucrose，25mM Tris-HCL and 10mM KH2PO4，pH7.4)，加入呼吸底物5mM malate和5 mM glutamate，最后加入0.2 mM ADP启动3态呼吸。30℃时氧气饱和溶解度为0.23μmol/ml。
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3.线粒体呼吸链酶复合体活性测定
(1)线粒体呼吸链酶的制备：将分离纯化的线粒体于-20℃/20℃反复冻融3次，破坏线粒体膜，获得游离的线粒体呼吸链酶。在温度30℃按以下条件测定各种酶复合体活性。
(2)酶复合体I(Complex I)活性测定：将5-10μg线粒体蛋白加入到Complex I反应缓冲液中(35Mm potassium phosphate buffer pH7.2，5mM MgCl2，2mM natriumazide，2μg/ml of antimycin，65μM ubiquinone-10)，混匀后加入0.13 mM NADH启动反应。1min内连续测定340nm处NADH吸收值的变化，以此为表示酶复合体I的活性。空白管则加入2μg/ml rotenone以抑制酶复合体I的活性。NADH的消光系数为E=6.81/Mm/cm。
(3)酶复合体II活性测定(Complex II)：通过监测被FADH2还原的2，6-dichlorophenolindophenol(DCPIP)量的变化来表示Complex II的活性。将5-10μg线粒体蛋白加入到Complex II反应缓冲液内，混匀后加入25mM琥珀酸盐(succinate)启动反应。根据600nm处DCPIP吸收值的变化，表示Complex II的活性。DCPIP的消光系数为E=21/mM/cn，缓冲液中含：35mM磷酸钾缓冲液，pH7.2，5mM MgCl2，2mM叠氮钠(natrium azide)，2μg/ml抗霉素(antimycin)，65μM泛醌10(ubiquinone-10)，2μg/ml鱼藤酮(rotenone)，88Mm DCPIP。
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(4)酶复合体III(Complex III)活性测定：将5-10μg线粒体蛋白加入到Complex III反应缓冲液内，混匀后加入100μM还原型ubiquinol-10启动反应。根据550nm处cytochrome c吸收值的变化来表示Complex III的活性。cytochrome c的消光系数为E=1.91/Mm/cm，缓冲液中含：35mM磷酸缓冲液，pH7.2，5mM MgCl2，2mM叠氮钠(natrium azide)，0.5mM EDTA，35μM氧化型细胞色素C(oxidated cytochrome C)。
还原型Ubiquinol-10制备：将10μMmol CoQ10完全溶解于四氢呋喃2ml中，加入NaBH4 1mg，反复吹打至溶液由黄色变为无色，再加入无水乙醚2ml中，合并萃取液后挥干乙醚，所得淡黄色粉末溶于1ml四氢呋喃和乙醇的混合液(1:1)，即得10mM ubiquinone-10。临用前现制备。
(5)酶复合体IV测定(Complex IV):将40-60μg线粒体蛋白加入到Complex IV反应缓冲液内[8.8 mM 磷酸缓中液，pH7.0， 0.1%还原型细胞色素C(以过量Vit C还原至OD550/OD565>12)]，根据550nm处细胞色素C吸收值的变化来表示Complex IV的活性。, http://www.100md.com(杜冠华)
采用Clark氧电极进行测定，反应槽体积为2ml，反应温度控制在30℃。用连二亚硫酸钠测定100%氧含量。将新鲜制备的线粒体蛋白0.5-1.0mg/ml加入到呼吸反应缓冲液内(150 mM sucrose，25mM Tris-HCL and 10mM KH2PO4，pH7.4)，加入呼吸底物5mM malate和5 mM glutamate，最后加入0.2 mM ADP启动3态呼吸。30℃时氧气饱和溶解度为0.23μmol/ml。
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3.线粒体呼吸链酶复合体活性测定
(1)线粒体呼吸链酶的制备：将分离纯化的线粒体于-20℃/20℃反复冻融3次，破坏线粒体膜，获得游离的线粒体呼吸链酶。在温度30℃按以下条件测定各种酶复合体活性。
(2)酶复合体I(Complex I)活性测定：将5-10μg线粒体蛋白加入到Complex I反应缓冲液中(35Mm potassium phosphate buffer pH7.2，5mM MgCl2，2mM natriumazide，2μg/ml of antimycin，65μM ubiquinone-10)，混匀后加入0.13 mM NADH启动反应。1min内连续测定340nm处NADH吸收值的变化，以此为表示酶复合体I的活性。空白管则加入2μg/ml rotenone以抑制酶复合体I的活性。NADH的消光系数为E=6.81/Mm/cm。
(3)酶复合体II活性测定(Complex II)：通过监测被FADH2还原的2，6-dichlorophenolindophenol(DCPIP)量的变化来表示Complex II的活性。将5-10μg线粒体蛋白加入到Complex II反应缓冲液内，混匀后加入25mM琥珀酸盐(succinate)启动反应。根据600nm处DCPIP吸收值的变化，表示Complex II的活性。DCPIP的消光系数为E=21/mM/cn，缓冲液中含：35mM磷酸钾缓冲液，pH7.2，5mM MgCl2，2mM叠氮钠(natrium azide)，2μg/ml抗霉素(antimycin)，65μM泛醌10(ubiquinone-10)，2μg/ml鱼藤酮(rotenone)，88Mm DCPIP。
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(4)酶复合体III(Complex III)活性测定：将5-10μg线粒体蛋白加入到Complex III反应缓冲液内，混匀后加入100μM还原型ubiquinol-10启动反应。根据550nm处cytochrome c吸收值的变化来表示Complex III的活性。cytochrome c的消光系数为E=1.91/Mm/cm，缓冲液中含：35mM磷酸缓冲液，pH7.2，5mM MgCl2，2mM叠氮钠(natrium azide)，0.5mM EDTA，35μM氧化型细胞色素C(oxidated cytochrome C)。
还原型Ubiquinol-10制备：将10μMmol CoQ10完全溶解于四氢呋喃2ml中，加入NaBH4 1mg，反复吹打至溶液由黄色变为无色，再加入无水乙醚2ml中，合并萃取液后挥干乙醚，所得淡黄色粉末溶于1ml四氢呋喃和乙醇的混合液(1:1)，即得10mM ubiquinone-10。临用前现制备。
(5)酶复合体IV测定(Complex IV):将40-60μg线粒体蛋白加入到Complex IV反应缓冲液内[8.8 mM 磷酸缓中液，pH7.0， 0.1%还原型细胞色素C(以过量Vit C还原至OD550/OD565>12)]，根据550nm处细胞色素C吸收值的变化来表示Complex IV的活性。, http://www.100md.com(杜冠华)