脑能量代谢与相关疾病(下)(3)
4.ATP酶活性测定
提取线粒体，经冻溶后测定ATP酶活性。ATP酶活性测定方法参见相关文献。
原理：线粒体悬液与ATP的Mg2+温浴，ATP被线粒体ATPase分解成ADP和无机磷，测定单位时间内分解出的无机磷量，代表ATPase活性。
样品测定：取线粒体悬液37℃温浴30min，加入10mmol/L ATP-10mmol/L MgCl2 0.5ml，37℃温浴10min，加入5%HCLO4 1ml，使蛋白变性，3000r/min离心10min，取上清液1ml，加入TCA-FeSO4 3ml，4.4%钼酸胺0.5ml，20-30℃ 放置10min后在650nm波长处测吸光度值A。
5.抗氧化酶活性测定(SOD) SOD活性测定：采用邻苯三酚自氧化法测定。邻苯三酚在碱性条件下能发生自氧化，生成有色中间物和超氧阴离子，后者对自氧化起催化作用，SOD能清除超氧阴离子，从而抑制邻苯三酚自氧化，依据邻苯三酚自氧化速率的变化，推算出SOD活力。取0.1ml脑组织匀浆液，加入3ml KH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH8.2)，混匀后加入0.15ml 7mM邻苯三酚(以10mM HCL新鲜配制，4℃保存)启动反应，以空白管调零，325nm处比色，记录20、40、60、80、100、120秒时的OD值，计算邻苯三酚自氧化速率的变化，根据SOD对邻苯三酚自氧化的抑制率，计算出每毫克蛋白含SOD活力单位，SOD活力单位定义为每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个活力单位。以Lowry法进行蛋白定量。
, 百拇医药
6.线粒体膜电位(△Ψ)的测定Rhodamin123为一种特异性的荧光染料，带有正电荷，可被线粒体摄取，其摄取率与膜电位成正比。采用Costar 96孔板进行测定，每也加入150 μl膜电位反应缓冲液(150mM蔗糖、5mM MgCl2、5mM琥珀酸钠、2.7μM rotenone、5mM KH2PO4、20mM Hepes，pH7.4)和1mM Rhodamin123 1μl，先用激发波长503nm、发射波长527nm，37℃条件下测定基础荧光值，再加入50μl线粒体蛋白悬液混匀，测定Rhodamin 123被线粒体摄取后的荧光值。以Lowry法进行蛋白定量。
计算：根据Nernst方程：
△Ψ=59log[Rh123]in/[Rh123]out
[Rh123]in根据1mg线粒体蛋白内基质体积为1μl进行计算。
, 百拇医药
7.线粒体内游离钙测定 采用Fura-2作为钙离子指示剂，首先用Fura-2/AM负载新鲜制备的线粒体，然后用双波长荧光法(激发光340nm/380nm，发射光520nm)测定Fura-2荧光值。双波长荧光的测定方法参见细胞内钙测定方法。
8.线粒体细胞色素C含量测定 细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白，分氧化型和还原型两种，在520nm处还原型细胞色素C有最收峰。采用Costar 96孔板进行测定，每孔加入新鲜提取的线粒体蛋白10μl和190μl磷酸盐缓冲液，再加少量的连二亚硫酸钠，振摇后在520nm处测定其吸光度，由标准曲线计算其浓度。以Lowry法进行蛋白定量。
9.线粒体膜流动性测定 线粒体蛋白与药物37℃温浴后，4℃离心，5000r/min 15min，弃去上清，加入磷酸钠缓冲液3.5ml，将沉淀悬起后立即依次测定起偏片和检偏片分别为0?或90?时的荧光强度(I)，按公式计算偏振度(P)和微粘度(η)。
, http://www.100md.com
G=IHV/IHH
P=(IVV-GIHH)/(IVV+GIHH)
η=2P×(0.46-P)
10.线粒体完整性鉴定
结构鉴定：线粒体结构测定采用电子显微镜观察的方法，可以直接进行组织切片后观察，也可以采用分离制备的线粒体固定后观察。操作方法参见有关形态学实验方法。
生化鉴定法：琥珀酸-细胞色素还原酶位于线粒体的内膜，催化琥珀酸与延胡索酸之间的反应，为线粒体特异性标志酶，其比例约占总细胞的一半；分别测定匀浆及一粒体中琥珀酸-细胞色素还原酶活性，从二者的比例鉴定标本的线粒体纯度。, 百拇医药(杜冠华)
提取线粒体，经冻溶后测定ATP酶活性。ATP酶活性测定方法参见相关文献。
原理：线粒体悬液与ATP的Mg2+温浴，ATP被线粒体ATPase分解成ADP和无机磷，测定单位时间内分解出的无机磷量，代表ATPase活性。
样品测定：取线粒体悬液37℃温浴30min，加入10mmol/L ATP-10mmol/L MgCl2 0.5ml，37℃温浴10min，加入5%HCLO4 1ml，使蛋白变性，3000r/min离心10min，取上清液1ml，加入TCA-FeSO4 3ml，4.4%钼酸胺0.5ml，20-30℃ 放置10min后在650nm波长处测吸光度值A。
5.抗氧化酶活性测定(SOD) SOD活性测定：采用邻苯三酚自氧化法测定。邻苯三酚在碱性条件下能发生自氧化，生成有色中间物和超氧阴离子，后者对自氧化起催化作用，SOD能清除超氧阴离子，从而抑制邻苯三酚自氧化，依据邻苯三酚自氧化速率的变化，推算出SOD活力。取0.1ml脑组织匀浆液，加入3ml KH2PO4-Na2HPO4缓冲液(pH8.2)，混匀后加入0.15ml 7mM邻苯三酚(以10mM HCL新鲜配制，4℃保存)启动反应，以空白管调零，325nm处比色，记录20、40、60、80、100、120秒时的OD值，计算邻苯三酚自氧化速率的变化，根据SOD对邻苯三酚自氧化的抑制率，计算出每毫克蛋白含SOD活力单位，SOD活力单位定义为每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量为一个活力单位。以Lowry法进行蛋白定量。
, 百拇医药
6.线粒体膜电位(△Ψ)的测定Rhodamin123为一种特异性的荧光染料，带有正电荷，可被线粒体摄取，其摄取率与膜电位成正比。采用Costar 96孔板进行测定，每也加入150 μl膜电位反应缓冲液(150mM蔗糖、5mM MgCl2、5mM琥珀酸钠、2.7μM rotenone、5mM KH2PO4、20mM Hepes，pH7.4)和1mM Rhodamin123 1μl，先用激发波长503nm、发射波长527nm，37℃条件下测定基础荧光值，再加入50μl线粒体蛋白悬液混匀，测定Rhodamin 123被线粒体摄取后的荧光值。以Lowry法进行蛋白定量。
计算：根据Nernst方程：
△Ψ=59log[Rh123]in/[Rh123]out
[Rh123]in根据1mg线粒体蛋白内基质体积为1μl进行计算。
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7.线粒体内游离钙测定 采用Fura-2作为钙离子指示剂，首先用Fura-2/AM负载新鲜制备的线粒体，然后用双波长荧光法(激发光340nm/380nm，发射光520nm)测定Fura-2荧光值。双波长荧光的测定方法参见细胞内钙测定方法。
8.线粒体细胞色素C含量测定 细胞色素C是一种稳定的可溶性蛋白，分氧化型和还原型两种，在520nm处还原型细胞色素C有最收峰。采用Costar 96孔板进行测定，每孔加入新鲜提取的线粒体蛋白10μl和190μl磷酸盐缓冲液，再加少量的连二亚硫酸钠，振摇后在520nm处测定其吸光度，由标准曲线计算其浓度。以Lowry法进行蛋白定量。
9.线粒体膜流动性测定 线粒体蛋白与药物37℃温浴后，4℃离心，5000r/min 15min，弃去上清，加入磷酸钠缓冲液3.5ml，将沉淀悬起后立即依次测定起偏片和检偏片分别为0?或90?时的荧光强度(I)，按公式计算偏振度(P)和微粘度(η)。
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G=IHV/IHH
P=(IVV-GIHH)/(IVV+GIHH)
η=2P×(0.46-P)
10.线粒体完整性鉴定
结构鉴定：线粒体结构测定采用电子显微镜观察的方法，可以直接进行组织切片后观察，也可以采用分离制备的线粒体固定后观察。操作方法参见有关形态学实验方法。
生化鉴定法：琥珀酸-细胞色素还原酶位于线粒体的内膜，催化琥珀酸与延胡索酸之间的反应，为线粒体特异性标志酶，其比例约占总细胞的一半；分别测定匀浆及一粒体中琥珀酸-细胞色素还原酶活性，从二者的比例鉴定标本的线粒体纯度。, 百拇医药(杜冠华)