脑能量代谢与相关疾病(下)(4)
取大鼠心肌匀浆10ml，5ml作为心肌匀浆样本，另5ml依步骤分离得到线粒体沉淀，加入0.25mol/L蔗糖-10mmol/L Tris-HCL(pH7.4)缓冲液5ml，悬起线粒体混匀。取心肌匀浆与线粒体悬液各1ml，分别以10mmol/L Tris-HCL稀释20倍，按下述步骤测定琥珀酸细胞色素还原酶的活力。
混匀，启动反应，在550nm连续测定吸光度的变化，每15秒读数一次，共计3min，以A-t作线性回归，求得斜率dA/dt，即每分钟A的变化值，依下面公式计算酶的活力。
酶活力(IU)=(dA/dt)×106×3/ε(μmol/min)
ε=1.96×107cm2/mol
, 百拇医药
11.线粒体肿胀测定 应用新鲜制备的线粒体(未经冻融)，测定前于4℃放置。将线粒体加入反应缓冲液(250mM蔗糖、5mM KH2PO4、3mM琥珀酸钠，pH7.2)中，使测定体系中含线粒体蛋白50μg，混匀后记录520nm处的吸光度值。进行组间比较，吸光度高，表明线粒体肿胀程度高。测定过程保持25℃恒温。
12.线粒体活性成分测定(GSH，GSH-PX，MDA，ATP)
还原型谷胱甘肽(GSH)含量测定：采用5,5'-二硫代双(2-硝基)苯甲酸(DTNB)法。GSH在中性条件下与DTNB反应，生成的巯基阴离子在412nm处产生强吸收。取0.8ml线粒体混悬液，与0.5ml4%磺基水杨酸混匀后于4℃2500g离心10min，取上清液0.5ml加入4‰DTNB显色液4.5ml(溶于pH8.2磷酸缓冲液)，混匀，室温下静置10min，以空白管调零，于412nm处测定OD值。按标准曲线计算出样品含GSH量，最后计算出每毫克蛋白样品中的GSH含量。以Lowry法进行蛋白定量。
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丙二醛(MDA)含量测定：以硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定。MDA可与TBA综合形成红色中间产物，在532nm处有最大吸收峰。取0.4ml脑组织匀浆液，加入0.8%TBA 1.6ml、DDH2O1ml，充分混匀，100℃水浴15min，冰浴终止反应，以空白管调零。于532nm处测定OD值。以四乙氧基丙烷(TMP)作为标准品制作标准曲线，根据标准曲线计算出MDA含量，并计算出每毫克蛋白中MDA含量。以Lowry法测定蛋白含量。
ATP含量测定：ATP在含有葡萄糖和NADP的碱性缓冲液中，经己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的催化下，可生成荧光物质NADPH，后者在激发波长为350nm时产生450nm荧光。根据所测NADPH量表示ATP量。
测定时每个反应管总体积为2ml，每管含100μl样品，100μM Glucose、50μM NADP、0.54u己糖激酶、0.07u葡萄糖-6-磷酸激酶。用25mM Tris-HCL缓冲液(含1mM MgCl2，0.5mM DTT，pH8.0)补足体积。充分混匀，置37℃水浴8min，用荧光分光光度计在激发光350nm和发射光450nm处读数。从标准曲线计算出样品ATP量，最后计算出每克组织中ATP含量。
七、作用于能量代谢过程的药物
在目前临床应用的药物中，直接以线粒体为作用靶点、完全通过能量改代谢过程发挥作用的药物非常有限，其主要原因是因为能量代谢过程复杂，影响病变的环节多，药物单方面的作用很难取取得理想的临床效果，而要发现能够从多方面调节能量代谢过程的单一药物又是非常困难的。, http://www.100md.com(杜冠华)
混匀，启动反应，在550nm连续测定吸光度的变化，每15秒读数一次，共计3min，以A-t作线性回归，求得斜率dA/dt，即每分钟A的变化值，依下面公式计算酶的活力。
酶活力(IU)=(dA/dt)×106×3/ε(μmol/min)
ε=1.96×107cm2/mol
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11.线粒体肿胀测定 应用新鲜制备的线粒体(未经冻融)，测定前于4℃放置。将线粒体加入反应缓冲液(250mM蔗糖、5mM KH2PO4、3mM琥珀酸钠，pH7.2)中，使测定体系中含线粒体蛋白50μg，混匀后记录520nm处的吸光度值。进行组间比较，吸光度高，表明线粒体肿胀程度高。测定过程保持25℃恒温。
12.线粒体活性成分测定(GSH，GSH-PX，MDA，ATP)
还原型谷胱甘肽(GSH)含量测定：采用5,5'-二硫代双(2-硝基)苯甲酸(DTNB)法。GSH在中性条件下与DTNB反应，生成的巯基阴离子在412nm处产生强吸收。取0.8ml线粒体混悬液，与0.5ml4%磺基水杨酸混匀后于4℃2500g离心10min，取上清液0.5ml加入4‰DTNB显色液4.5ml(溶于pH8.2磷酸缓冲液)，混匀，室温下静置10min，以空白管调零，于412nm处测定OD值。按标准曲线计算出样品含GSH量，最后计算出每毫克蛋白样品中的GSH含量。以Lowry法进行蛋白定量。
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丙二醛(MDA)含量测定：以硫代巴比妥酸(TBA)比色法测定。MDA可与TBA综合形成红色中间产物，在532nm处有最大吸收峰。取0.4ml脑组织匀浆液，加入0.8%TBA 1.6ml、DDH2O1ml，充分混匀，100℃水浴15min，冰浴终止反应，以空白管调零。于532nm处测定OD值。以四乙氧基丙烷(TMP)作为标准品制作标准曲线，根据标准曲线计算出MDA含量，并计算出每毫克蛋白中MDA含量。以Lowry法测定蛋白含量。
ATP含量测定：ATP在含有葡萄糖和NADP的碱性缓冲液中，经己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的催化下，可生成荧光物质NADPH，后者在激发波长为350nm时产生450nm荧光。根据所测NADPH量表示ATP量。
测定时每个反应管总体积为2ml，每管含100μl样品，100μM Glucose、50μM NADP、0.54u己糖激酶、0.07u葡萄糖-6-磷酸激酶。用25mM Tris-HCL缓冲液(含1mM MgCl2，0.5mM DTT，pH8.0)补足体积。充分混匀，置37℃水浴8min，用荧光分光光度计在激发光350nm和发射光450nm处读数。从标准曲线计算出样品ATP量，最后计算出每克组织中ATP含量。
七、作用于能量代谢过程的药物
在目前临床应用的药物中，直接以线粒体为作用靶点、完全通过能量改代谢过程发挥作用的药物非常有限，其主要原因是因为能量代谢过程复杂，影响病变的环节多，药物单方面的作用很难取取得理想的临床效果，而要发现能够从多方面调节能量代谢过程的单一药物又是非常困难的。, http://www.100md.com(杜冠华)