采用PCR技术快速诊断MRSA感染对合理治疗MRSA感染的意义(2)
3.3 样本DNA的制备
Unal等建立了DNA快速制备方法，用lysostaphin处理细菌悬液后，再用蛋白酶K消化后即可用于扩增。整个制备过程约在30min内完成，大大缩短了检测时间。
3.4 反应过程
PCR是将样本DNA与寡聚核苷酸引物、对热稳定的TaqDNA多聚酶、脱氧核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)、MgCl2等与适宜的反应缓冲液混合后，重复加热与冷却，形成一个反复循环的PCR过程，经25～40个循环，特异DNA片断呈指数积聚，其数量足以用于检测分析。
PCR过程是在三个不同温度下完成的，即高温变性、冷却后引物与模板复性及在适当温度下的延伸。变性条件多采用94℃,30s；复性温度直接影响PCR结果的特异性。温度提高会增加复性的特异性，但同时会降低引物与模板复性的量，从而降低扩增效率。降低温度则提高扩增效率，降低复性的特异性。因此，复性条件多为55℃,30s；虽然TaqDNA多聚酶对热稳定，但是过高或过低的温度均会降低酶的活性，其最适反应温度在70～80℃之间,因此延伸温度通常为72℃. 由于不同研究者设计的扩增片断长度不同，延伸时间从5s～2min不等。TaqDNA多聚酶是一种高活性酶，在70℃时扩增效率为每秒每个酶分子可延伸150个核苷，所以过长的延伸时间似无必要。通常反应循环数在25～40个之间。
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3.4检测结果
扩增产物一般用含溴化乙啶的琼脂糖凝胶电泳方法检测。经短时间电泳后，在紫外线下观察特定长度的DNA片断。
4、PCR方法与传统方法的比较
与体外敏感试验及其它检测方法相比，PCR方法在检测的敏感性、特异性及简单快捷方面有很大优点：
4.1 敏感性
MRSA耐药性的表达分为同质性和异质性两种。其中以异质性多见，异质性耐药性的表达频率大约只有10-7～10-3甚至更低，在接种量过低的时候，不易检出从而出现假阴性结果。与之不同的是，PCR方法通过直接检测细菌染色体上的mecA基因确定MRSA，因而不受上述试验条件的影响。同时由于PCR方法能对目的DNA在几小时内扩大上百万倍，因而只有标本DNA中仅含有极微量的mecA基因，经25～40个反应循环后，扩增片断即可用普通的琼脂糖凝胶电泳检出，随着对检测技术各个环节的改进，对MRSA的检测灵敏度已由起初的约103个细胞的检出量降低到30个细胞的检测量。
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4.2 特异性
尽管有报道认为甲氧西林耐药性还存在着其它耐药机制，但PBPs的改变是其最主要的耐药机制。且编码PBP2a的mecA基因只存在于MRSA及其它对甲氧西林耐药的葡萄球菌中，因而特异性很高。
由于这个特点，在检测MRSA的研究中，大多研究者对PCR方法与体外敏感试验及核酸杂交方法进行比较研究的结果均显示，PCR方法与各种核酸杂交方法对MRSA的检测结果均完全一致，且在经过体外敏感试验检测的MRSA菌株中，有98%以上的菌株显示PCR结果阳性，表现出与其它方法的一致性。
非常有意义的是，有不同研究者在PCR方法检测MRSA的研究中，均报道有少数MSSA的PCR结果呈阳性。即这些MSSA虽然在体外敏感试验中对甲氧西林机其它抗菌药物敏感，但其染色体上却携带有mecA基因。
对MRSA耐药的研究表明，mecA基因为编码特异青霉素结合蛋白PBP2a的结构基因。mecA基因的表达受mec基因中mecI-mecR1基因的调节。mecI基因编码MECI蛋白，该蛋白为抑制子。mecR1基因编码MECR1蛋白，该蛋白为辅助诱导因子。当细菌处于含青霉素或头霉菌素类抗生素cafoxitin的环境时，MECR1蛋白因接触该类抗生素，被结合诱导而活化，从而移去抑制子MECI蛋白，使处于MECI蛋白抑制之下的mecA基因活化，编码生成PBP2a。, http://www.100md.com(李耘)
Unal等建立了DNA快速制备方法，用lysostaphin处理细菌悬液后，再用蛋白酶K消化后即可用于扩增。整个制备过程约在30min内完成，大大缩短了检测时间。
3.4 反应过程
PCR是将样本DNA与寡聚核苷酸引物、对热稳定的TaqDNA多聚酶、脱氧核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)、MgCl2等与适宜的反应缓冲液混合后，重复加热与冷却，形成一个反复循环的PCR过程，经25～40个循环，特异DNA片断呈指数积聚，其数量足以用于检测分析。
PCR过程是在三个不同温度下完成的，即高温变性、冷却后引物与模板复性及在适当温度下的延伸。变性条件多采用94℃,30s；复性温度直接影响PCR结果的特异性。温度提高会增加复性的特异性，但同时会降低引物与模板复性的量，从而降低扩增效率。降低温度则提高扩增效率，降低复性的特异性。因此，复性条件多为55℃,30s；虽然TaqDNA多聚酶对热稳定，但是过高或过低的温度均会降低酶的活性，其最适反应温度在70～80℃之间,因此延伸温度通常为72℃. 由于不同研究者设计的扩增片断长度不同，延伸时间从5s～2min不等。TaqDNA多聚酶是一种高活性酶，在70℃时扩增效率为每秒每个酶分子可延伸150个核苷，所以过长的延伸时间似无必要。通常反应循环数在25～40个之间。
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3.4检测结果
扩增产物一般用含溴化乙啶的琼脂糖凝胶电泳方法检测。经短时间电泳后，在紫外线下观察特定长度的DNA片断。
4、PCR方法与传统方法的比较
与体外敏感试验及其它检测方法相比，PCR方法在检测的敏感性、特异性及简单快捷方面有很大优点：
4.1 敏感性
MRSA耐药性的表达分为同质性和异质性两种。其中以异质性多见，异质性耐药性的表达频率大约只有10-7～10-3甚至更低，在接种量过低的时候，不易检出从而出现假阴性结果。与之不同的是，PCR方法通过直接检测细菌染色体上的mecA基因确定MRSA，因而不受上述试验条件的影响。同时由于PCR方法能对目的DNA在几小时内扩大上百万倍，因而只有标本DNA中仅含有极微量的mecA基因，经25～40个反应循环后，扩增片断即可用普通的琼脂糖凝胶电泳检出，随着对检测技术各个环节的改进，对MRSA的检测灵敏度已由起初的约103个细胞的检出量降低到30个细胞的检测量。
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4.2 特异性
尽管有报道认为甲氧西林耐药性还存在着其它耐药机制，但PBPs的改变是其最主要的耐药机制。且编码PBP2a的mecA基因只存在于MRSA及其它对甲氧西林耐药的葡萄球菌中，因而特异性很高。
由于这个特点，在检测MRSA的研究中，大多研究者对PCR方法与体外敏感试验及核酸杂交方法进行比较研究的结果均显示，PCR方法与各种核酸杂交方法对MRSA的检测结果均完全一致，且在经过体外敏感试验检测的MRSA菌株中，有98%以上的菌株显示PCR结果阳性，表现出与其它方法的一致性。
非常有意义的是，有不同研究者在PCR方法检测MRSA的研究中，均报道有少数MSSA的PCR结果呈阳性。即这些MSSA虽然在体外敏感试验中对甲氧西林机其它抗菌药物敏感，但其染色体上却携带有mecA基因。
对MRSA耐药的研究表明，mecA基因为编码特异青霉素结合蛋白PBP2a的结构基因。mecA基因的表达受mec基因中mecI-mecR1基因的调节。mecI基因编码MECI蛋白，该蛋白为抑制子。mecR1基因编码MECR1蛋白，该蛋白为辅助诱导因子。当细菌处于含青霉素或头霉菌素类抗生素cafoxitin的环境时，MECR1蛋白因接触该类抗生素，被结合诱导而活化，从而移去抑制子MECI蛋白，使处于MECI蛋白抑制之下的mecA基因活化，编码生成PBP2a。, http://www.100md.com(李耘)