肠病毒RNA和抗ANT抗体在健康献血员中检出的意义(1)
近年来，我们在检测扩张型心肌病(DCM)患者血清肠病毒RNA和抗心肌线粒体ADP/ATP载体(以下简称ANT)抗体时，以健康献血员血清作为阴性对照，发现在少数健康献血员血清中也可以检测出上述病毒和自身抗体[1]。由于肠病毒感染和抗ANT抗体与扩张型心肌病的异常免疫应答有关，抗ANT抗体可以介导心肌细胞钙电流增加和钙超负荷，导致细胞损害[2-4]。由于肠病毒引起的呼吸道和肠道感染容易在人群中流行，在健康献血员血清中检测出肠病毒RNA和抗ANT抗体是否有临床意义，值得关注。我们采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和酶联免疫吸附实验(ELISA法)对48例健康献血员血清肠病毒RNA和抗ANT抗体进行了检测，并与同时48例DCM患者检测结果进行了对比观察，对抗体阳性和病毒阳性的献血员及其受血者进行了追踪观察，现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 研究对象
, 百拇医药
本组96例，健康献血员(HD)组：健康献血员48例，男32例，女16例，年龄37.8±17.4岁。采血前3周内无上呼吸道感染、急性肠炎等病史。DCM组：DCM患者48例，男26例，女22例，年龄42.3±18.2岁。临床诊断参照1995年WHO/ISFC心肌病的定义和分类标准进行[6]。对健康献血员检测结果异常者及其受血者进行3个月病原学监测和临床随访。
1.2 肠病毒RNA检测
1.2.1 肠病毒RNA的提取：取血清100μl，依次加入GITC变性液200μl，氯仿-异戊醇(49:1)50μl，2mol/L NaAc 25μl(pH4.0)，水饱和酚 200μl。剧烈振荡15s后置-20℃冷却10min，再以12000 r/min离心5 min。取上清200μl加入等体积异丙醇，在-20℃中静置1h，以12000r/min离心10min，弃上清液用乙醇洗涤沉淀，开盖自然挥发或烘干备用。
, 百拇医药
1.2.2 RT-PCR：肠病毒RNA提取后再按以下比例加入RT-PCR各成分：双蒸水14.35 μl，10×Buffer 2μl，15mmol MgCL22 μl，10mmol/L dNTP各0.1μl共0.4μl，引物P1(50pmol)0.4 μl，P2 (50pmol)0.4μl，Taq酶0.2μl，逆转录酶AMV 0.25μl。42℃恒温水浴逆转录30min即可进行扩增。扩增程序如下：94℃变性5min；94℃变性30s；60℃复性30s；72℃延伸90s；共30个循环，再在72℃中延伸5min。
1.2.3 电泳：取扩增产物6μl加溴酚蓝显示剂点样于2%琼脂糖凝胶(含EB 0.5μg/ml),100V电泳30min，于紫外线灯下观察结果。
1.3 多肽合成
根据计算机预测心肌ANT抗原决定簇的氨基酸序列，在多肽合成仪(PSSM-8型Shimadzu公司生产)上以固相合成法合成ANT多肽，用高压液相色谱法对合成产物的纯度进行鉴定，其纯度>95%。
1.4 抗ANT抗体检测
以碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释ANT多肽(终浓度50μg/ml),包被96孔板，每孔100μl，置4℃中过夜。倾去包被液，用洗涤液(pH 7.4，0.01mol/L PBS-Tween 20)加满各孔，置3min，洗涤3次，然后加入待检血清(1:100)，以37℃水温浴2h。洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(1:3 000)(同济医学院附属协和医院病毒室产品)，以37℃水温浴1h洗涤后加入0.03% 双氧水和0.01%TMB反应15min后，以2mol/L硫酸终止反应。于酶标仪450 nm处读数并记录OD值，以大于健康组OD值的均数与2.1倍标准差之和为阳性。, http://www.100md.com(胡丽华 苑海涛 廖玉华)
1 资料与方法
1.1 研究对象
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本组96例，健康献血员(HD)组：健康献血员48例，男32例，女16例，年龄37.8±17.4岁。采血前3周内无上呼吸道感染、急性肠炎等病史。DCM组：DCM患者48例，男26例，女22例，年龄42.3±18.2岁。临床诊断参照1995年WHO/ISFC心肌病的定义和分类标准进行[6]。对健康献血员检测结果异常者及其受血者进行3个月病原学监测和临床随访。
1.2 肠病毒RNA检测
1.2.1 肠病毒RNA的提取：取血清100μl，依次加入GITC变性液200μl，氯仿-异戊醇(49:1)50μl，2mol/L NaAc 25μl(pH4.0)，水饱和酚 200μl。剧烈振荡15s后置-20℃冷却10min，再以12000 r/min离心5 min。取上清200μl加入等体积异丙醇，在-20℃中静置1h，以12000r/min离心10min，弃上清液用乙醇洗涤沉淀，开盖自然挥发或烘干备用。
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1.2.2 RT-PCR：肠病毒RNA提取后再按以下比例加入RT-PCR各成分：双蒸水14.35 μl，10×Buffer 2μl，15mmol MgCL22 μl，10mmol/L dNTP各0.1μl共0.4μl，引物P1(50pmol)0.4 μl，P2 (50pmol)0.4μl，Taq酶0.2μl，逆转录酶AMV 0.25μl。42℃恒温水浴逆转录30min即可进行扩增。扩增程序如下：94℃变性5min；94℃变性30s；60℃复性30s；72℃延伸90s；共30个循环，再在72℃中延伸5min。
1.2.3 电泳：取扩增产物6μl加溴酚蓝显示剂点样于2%琼脂糖凝胶(含EB 0.5μg/ml),100V电泳30min，于紫外线灯下观察结果。
1.3 多肽合成
根据计算机预测心肌ANT抗原决定簇的氨基酸序列，在多肽合成仪(PSSM-8型Shimadzu公司生产)上以固相合成法合成ANT多肽，用高压液相色谱法对合成产物的纯度进行鉴定，其纯度>95%。
1.4 抗ANT抗体检测
以碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释ANT多肽(终浓度50μg/ml),包被96孔板，每孔100μl，置4℃中过夜。倾去包被液，用洗涤液(pH 7.4，0.01mol/L PBS-Tween 20)加满各孔，置3min，洗涤3次，然后加入待检血清(1:100)，以37℃水温浴2h。洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体(1:3 000)(同济医学院附属协和医院病毒室产品)，以37℃水温浴1h洗涤后加入0.03% 双氧水和0.01%TMB反应15min后，以2mol/L硫酸终止反应。于酶标仪450 nm处读数并记录OD值，以大于健康组OD值的均数与2.1倍标准差之和为阳性。, http://www.100md.com(胡丽华 苑海涛 廖玉华)