黄芪对柯萨奇B3病毒核糖核酸作用的研究及其机理探讨(1)
有关心肌炎病毒在心肌中的持续存在及可能发展为扩张型心肌病的问题已成为近年来研究的热点[1,2]。因此，对病毒性心肌炎药物治疗的探讨更为引人关注。本室曾对黄芪的抗病毒治疗作用进行了一些基础和临床研究，取得了一些结果[3,4]。本研究利用负股RNA探针作RNA-RNA原位杂交检测和对其阳性信号进行图像处理，定量分析黄芪对急性柯萨奇B3病毒(CVB3)心肌炎小鼠心肌中CVB3-RNA含量的影响，并对其作用机理进行了初步探讨。
材料与方法
1.CVB3-RNA的RNA-RNA原位杂交检测和定量分析
1.1 实验性急性小鼠病毒性心肌炎模型4周龄的雄性Balb/c小鼠60只，体重10—12g(上海医科大学实验动物部提供)，分4组：A组(20)只为病毒对照组，腹腔注射0.2ml CVB3病毒液(Nancy株，组织感染率为2×108.5)0.5h后每天腹腔注射0.1ml生理盐水，共7天；B组(30只)为黄芪治疗组，接种病毒同A组，每天腹腔注射0.1ml黄芪注射液(含黄芪生药4g/2ml安瓶，批号为840308，由中山医院药剂科提供)，共7天；C组(5只)注射不含病毒的 Eagle维持液，每天注射0.lml生理盐水同A组；D组(5只)每天注射黄芪注射液方法同B组。第8天杀鼠取心肌，用甲醛固定，石蜡包埋，切片，玻片处理参考文献[5]方法。
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1.2 CVB3 负股RNA探针制备 将克隆有柯萨奇B3病毒全长cDNA质粒pSPT18，简称p CVB3一R1(由Kandolf教授提供)转化大肠杆菌DH5a，进行质粒扩增，超离回收和纯化，限制性内切酶Smal酶切后，在SP 6 RNA聚合酶作用下，p CVB3-R1体外转录合成6.3千个碱基负股RNA，以同位素35S标记作阳性探针；质粒pSPT18的体外转录产物以同位素35S标记作阴性探针。主要步骤参照文献[5]。
l.3 RNA-RNA原位杂交 详细步骤参考文献[6]。
1.4 阳性杂交信号的定量图像分析放射自显影和染色后的杂交切片在光镜下(×10)，通过VIDSⅢ图像分析仪对阳性杂交信号逐个进行处理和分析，整合出信号的面积(um2)和被检测心肌总面积(mm2)，计算其比值(um2/mm2)，即单位心肌总面积中阳性杂交信号面积[6]。
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2 β一干扰素(IFN)mRNA的诱导和检测
2.1 黄芪对β-IFN mRNA的诱导人心肌成纤维细胞(Kandolf教授提供)传代后，分3组。第1组为对照组：加Eagle维持液后 3、6、9、12、18、24h分别经胰酶消化收集细胞，以无钙、镁离子磷酸缓冲液洗涤2次，一部分细胞沉淀在载玻片上，室温下晾干，醋酸/乙醇(体积比为1：3)固定，在100%乙醇中-80℃保存，供原位杂交用；另一部分细胞以一步法提取总 RNA[7]，供 Northern-blot检测；第2、3组为黄芪诱导组：每毫升细胞生长液分别加0.l和0.2 ml黄芪注射液(同前)，收集细胞及以后处理方法同第1组，2.2 β-IFN探针制备 克隆有β一干扰素基因的重组质粒 Fg 4△H(由Kandolf提供)经限制性内切酶ECOR I和Hind Ⅲ酶切后得到β
-IFN片段(1.8kb) [8]，缺口翻译标记同位素35S作探针(试剂盒购自Boeh ringer Mannheim公司，操作方法参照说明书), http://www.100md.com(彭天庆 杨英珍 Kandolf R Riesemann H)
材料与方法
1.CVB3-RNA的RNA-RNA原位杂交检测和定量分析
1.1 实验性急性小鼠病毒性心肌炎模型4周龄的雄性Balb/c小鼠60只，体重10—12g(上海医科大学实验动物部提供)，分4组：A组(20)只为病毒对照组，腹腔注射0.2ml CVB3病毒液(Nancy株，组织感染率为2×108.5)0.5h后每天腹腔注射0.1ml生理盐水，共7天；B组(30只)为黄芪治疗组，接种病毒同A组，每天腹腔注射0.1ml黄芪注射液(含黄芪生药4g/2ml安瓶，批号为840308，由中山医院药剂科提供)，共7天；C组(5只)注射不含病毒的 Eagle维持液，每天注射0.lml生理盐水同A组；D组(5只)每天注射黄芪注射液方法同B组。第8天杀鼠取心肌，用甲醛固定，石蜡包埋，切片，玻片处理参考文献[5]方法。
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1.2 CVB3 负股RNA探针制备 将克隆有柯萨奇B3病毒全长cDNA质粒pSPT18，简称p CVB3一R1(由Kandolf教授提供)转化大肠杆菌DH5a，进行质粒扩增，超离回收和纯化，限制性内切酶Smal酶切后，在SP 6 RNA聚合酶作用下，p CVB3-R1体外转录合成6.3千个碱基负股RNA，以同位素35S标记作阳性探针；质粒pSPT18的体外转录产物以同位素35S标记作阴性探针。主要步骤参照文献[5]。
l.3 RNA-RNA原位杂交 详细步骤参考文献[6]。
1.4 阳性杂交信号的定量图像分析放射自显影和染色后的杂交切片在光镜下(×10)，通过VIDSⅢ图像分析仪对阳性杂交信号逐个进行处理和分析，整合出信号的面积(um2)和被检测心肌总面积(mm2)，计算其比值(um2/mm2)，即单位心肌总面积中阳性杂交信号面积[6]。
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2 β一干扰素(IFN)mRNA的诱导和检测
2.1 黄芪对β-IFN mRNA的诱导人心肌成纤维细胞(Kandolf教授提供)传代后，分3组。第1组为对照组：加Eagle维持液后 3、6、9、12、18、24h分别经胰酶消化收集细胞，以无钙、镁离子磷酸缓冲液洗涤2次，一部分细胞沉淀在载玻片上，室温下晾干，醋酸/乙醇(体积比为1：3)固定，在100%乙醇中-80℃保存，供原位杂交用；另一部分细胞以一步法提取总 RNA[7]，供 Northern-blot检测；第2、3组为黄芪诱导组：每毫升细胞生长液分别加0.l和0.2 ml黄芪注射液(同前)，收集细胞及以后处理方法同第1组，2.2 β-IFN探针制备 克隆有β一干扰素基因的重组质粒 Fg 4△H(由Kandolf提供)经限制性内切酶ECOR I和Hind Ⅲ酶切后得到β
-IFN片段(1.8kb) [8]，缺口翻译标记同位素35S作探针(试剂盒购自Boeh ringer Mannheim公司，操作方法参照说明书), http://www.100md.com(彭天庆 杨英珍 Kandolf R Riesemann H)