黄芪对柯萨奇B3病毒核糖核酸作用的研究及其机理探讨(2)
2.3 β-IFN mRNA的Northern转印和原位杂交检测Northern-blot检测简述如下：20ug总RNA(每个标本)经甲酚胺凝胶电泳后，用经处理而无RNA酶的双蒸水小心洗涤凝胶，使用50mmol/L氢氧化钠溶液作转移液，转移12h，紫外灯下查看以确保凝胶上的RNA基本转移到尼龙膜上，然后用2×SSC洗膜，室温晾干。杂交液探针浓度为1.4×107cpm/ml，杂交温度为42℃，时间为20 h。置4℃放射自显影 6周观察结果。DNA-RNA原位杂交参照RNA-RNA原位杂交，但稍有不同：杂交前探针需在100℃变性5min，在30℃杂交40h，杂交后无需RNA酶处理。
结 果
1 小鼠存活率和心肌的病理改变 A组小鼠存活率50%，B组小鼠存活率63.33%；A组小鼠心肌病理学积分2055±1.16分，明显高于B组小鼠1.42±1.25分(P<0.05)；C和D两组小鼠均存活，且未见任何心肌病理改变(心肌的病理组织学积分计算方法：心肌组织坏死面积<25%积分为1；25%一50%为2；50+%～75%为3；>75%为4)。结果可见黄芪能减轻心肌的病理损害。
, http://www.100md.com
2 RNA-RNA原位杂交的特异性阳性探针检测结果显示；A组10只小鼠心肌切片均有阳性信号发现；C和D组未出现阳性信号。阴性探针检测未发现任何阳性信号。可见此方法特异性高，可对肠道病毒RNA进行特异检测。
3 阳性杂交信号的定量分析阳性杂交信号的面积反映被检测CVB3-RNA的含量，本结果显示黄芪治疗组小鼠单位心肌总面积中阳性杂交信号面积(183.93±173.16um2/mm2)与病毒对照组(1048.53±1907.54um2/mm2)相比明显减少(P<0.01)，说明黄芪能抑制CVB3-RNA的复制。
4
β-IFN mRNA的检测 Northern-blot和DNA-RNA原位杂交在各组标本中均未发现阳性信号。提示黄芪在人心肌成纤细细胞中并不能诱生β一IFN。
, 百拇医药
讨 论
最近研究证实病毒在心肌中的持续感染与慢性心肌炎密切相关，对扩张型心肌病的发病亦起重要作用，且直接影响到该病的预后[1,2]。因而探讨有效的抗病毒作用药物具有重要意义。众多的研究报道黄芪具有抗病毒、调节免疫功能、改善心功能、对干扰素系统(γ-IFN、α-IFN)有激活等作用[3，4]，在淋巴细胞中可诱生γ-IFN[9]。本文结果发现黄芪对急性CVB3心肌炎小鼠心肌中的病毒RNA复制有很好的抑制作用和减轻心肌病理改变，这为黄芪治疗病毒性心肌炎提供理论依据。我们曾观察到在培养大鼠心肌细胞中接种CVB前、后加黄芪注射液，其结果截然不同：接种CVB后加黄芪有保护作用，接种前加黄芪无作用，可见黄芪的抗病毒作用与宿主细胞膜上的病毒受体无关；而使用α-IFN[10]、β-IFN在接种CVB前、后均有保护作用，而γ-IFN对此作用则不明显[11]。由此可知：黄芪对α、γ-IFN的诱生并不是其抗病毒作用的主要机制。本研究结果提示黄芪的抗病毒作用与β一IFN无关。因此，黄芪的抗病毒机理尚需进一步深入探讨。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1.Kandolf R，Klingel k，Canu A，et al.Enterovirus-Induced Cardiomyopathy：Molecular analysis of
acute and persistent myocardial infection. In；Figulla HR，Kandolf R，McManus B，eds.Idiopathic dilated cardiomyopathy cellular and molecular mechanism clinical consequences.Berlin Heldelberg，New York：Springer Verlay 1993：267—300., 百拇医药(彭天庆 杨英珍 Kandolf R Riesemann H)
结 果
1 小鼠存活率和心肌的病理改变 A组小鼠存活率50%，B组小鼠存活率63.33%；A组小鼠心肌病理学积分2055±1.16分，明显高于B组小鼠1.42±1.25分(P<0.05)；C和D两组小鼠均存活，且未见任何心肌病理改变(心肌的病理组织学积分计算方法：心肌组织坏死面积<25%积分为1；25%一50%为2；50+%～75%为3；>75%为4)。结果可见黄芪能减轻心肌的病理损害。
, http://www.100md.com
2 RNA-RNA原位杂交的特异性阳性探针检测结果显示；A组10只小鼠心肌切片均有阳性信号发现；C和D组未出现阳性信号。阴性探针检测未发现任何阳性信号。可见此方法特异性高，可对肠道病毒RNA进行特异检测。
3 阳性杂交信号的定量分析阳性杂交信号的面积反映被检测CVB3-RNA的含量，本结果显示黄芪治疗组小鼠单位心肌总面积中阳性杂交信号面积(183.93±173.16um2/mm2)与病毒对照组(1048.53±1907.54um2/mm2)相比明显减少(P<0.01)，说明黄芪能抑制CVB3-RNA的复制。
4
β-IFN mRNA的检测 Northern-blot和DNA-RNA原位杂交在各组标本中均未发现阳性信号。提示黄芪在人心肌成纤细细胞中并不能诱生β一IFN。
, 百拇医药
讨 论
最近研究证实病毒在心肌中的持续感染与慢性心肌炎密切相关，对扩张型心肌病的发病亦起重要作用，且直接影响到该病的预后[1,2]。因而探讨有效的抗病毒作用药物具有重要意义。众多的研究报道黄芪具有抗病毒、调节免疫功能、改善心功能、对干扰素系统(γ-IFN、α-IFN)有激活等作用[3，4]，在淋巴细胞中可诱生γ-IFN[9]。本文结果发现黄芪对急性CVB3心肌炎小鼠心肌中的病毒RNA复制有很好的抑制作用和减轻心肌病理改变，这为黄芪治疗病毒性心肌炎提供理论依据。我们曾观察到在培养大鼠心肌细胞中接种CVB前、后加黄芪注射液，其结果截然不同：接种CVB后加黄芪有保护作用，接种前加黄芪无作用，可见黄芪的抗病毒作用与宿主细胞膜上的病毒受体无关；而使用α-IFN[10]、β-IFN在接种CVB前、后均有保护作用，而γ-IFN对此作用则不明显[11]。由此可知：黄芪对α、γ-IFN的诱生并不是其抗病毒作用的主要机制。本研究结果提示黄芪的抗病毒作用与β一IFN无关。因此，黄芪的抗病毒机理尚需进一步深入探讨。
, http://www.100md.com
参 考 文 献
1.Kandolf R，Klingel k，Canu A，et al.Enterovirus-Induced Cardiomyopathy：Molecular analysis of
acute and persistent myocardial infection. In；Figulla HR，Kandolf R，McManus B，eds.Idiopathic dilated cardiomyopathy cellular and molecular mechanism clinical consequences.Berlin Heldelberg，New York：Springer Verlay 1993：267—300., 百拇医药(彭天庆 杨英珍 Kandolf R Riesemann H)