黄芪总皂甙对病毒性心肌炎小鼠心肌损伤及肌浆网钙泵的影响(1)
黄芪治疗病毒性心肌炎(VMC)具有一定的疗效[1],但黄芪含有多种皂甙、黄酮、多糖，以及氨基酸、亚油酸、生物碱、胆碱、β-谷甾醇等复杂的化学成分，为深入探讨其药效及作用机制，本研究观查了黄芪总皂甙对病毒性心肌炎小鼠心肌损伤的保护作用及其对心肌肌浆网钙泵的影响。
一、材料和方法
1.动物 4周龄雄性纯种BALB/c小鼠(南京医科大学动物中心提供)，共84只。
2.病毒 柯萨奇B 3亲心肌病毒株(CVB3m),由上海第二医科大学微生物学教研室刘晶星教授赠送。病毒原液效价，50%组织感染率(TCID50)为10-6。
3.药物和试剂 (1)黄芪总皂甙注射液(AS)：黄芪总皂甙由南京中医药大学中医药研究院从蒙古黄芪中提取，为淡黄色粉末，经鉴定为三萜类皂甙；参照文献[2]以黄芪甲甙(中国药品生物制品检定所出品)为标准测定，所提黄芪总皂甙中含26%的黄芪甲甙。以生理盐水溶解，调pH至7.4，0.45μm微孔滤膜过滤,得1mg/ml的AS，分装备用。(2)黄芪注射液(AI.4g/2ml).(3)试剂：对-硝基酚(p-NP)、对-硝基苯磷酸(p-NPP)，Hepes，EGTA，TritonX-100均购自Sigma公司，其余为国产分析纯。
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4.病毒感染及分组给药 BALB/c小鼠随机分成4组。模型组(感染加生理盐水)，22只；AS组(感染加AS)，26只；AI组(感染加AI)，18只；对照组，18只。模型组、AS、AI组分别于实验当天每鼠腹腔注射0.1ml,2×104TCID50的CVB3m; 对照组每鼠腹腔注射0.1ml不含病毒的培养液.于病毒感染后开始，模型组及对照组小鼠每只每天腹腔注射生理盐水0.15ml，AS组小鼠则每只腹腔注射AS 0.15ml,AI组每只腹腔注射AI 0.15ml，各组小鼠均连续7天腹腔注射。
5.标本取材 于实验第8天,从小鼠眼眶取血,分离血清待检.取血后处死,取心脏中下1/3处的部分心肌,用10%福尔马林固定待用.取其余心室肌组织,-70℃保存备用。
6.观测指标
6.1统计小鼠死亡率.
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6.2心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I , cTnI)血清cTnI含量,采用本室建立的改良Bodor夹心ELISA法测定[3],浓度单位为μg/L.
6.3病理组织学检查 10%福尔马林固定的心肌用石蜡包埋后作连续切片,HE染色,光镜下观察心肌病理改变,并参考文献方法[4]计算心肌病理组织学积分.每张切片计算其中心肌坏死及炎症面积与整个心肌切片面积的比值:无病变计0分,病变面积75%计4分。
6.4肌浆网钙泵(Sarco/Endoplasmic Ca-ATP ase ,SERCA)活力 心肌SERCA活力,采用本室改良建立的 p-NPP法测定[5].反映体系含心肌匀浆,20mmol/L Hepes pH7.4 . 1mmol/L Mgcl2, 1mmol/L EGTA,0.01‰ TritonX-100, 100mmol/L KCL .加或不加0.8mmol/L CaCl2,预温 37℃ 10min加 10mmol/L
p-NPP37℃反应30min.结束时用冷缓冲液终止反应,在波长410nm处测定p-NP生成量,与标准 p-NP浓度曲线比较,并与时间及组织蛋白量相比即得SERCA活力单位(μmol/g pro.min).
7.统计学分析 均数组间比较用t检验.率的比较用х2检验,cTnI数据用秩和检验。, http://www.100md.com(陆曙 张寄南 杨笛 徐晋丹 陈相健 方五旺 马文珠)
一、材料和方法
1.动物 4周龄雄性纯种BALB/c小鼠(南京医科大学动物中心提供)，共84只。
2.病毒 柯萨奇B 3亲心肌病毒株(CVB3m),由上海第二医科大学微生物学教研室刘晶星教授赠送。病毒原液效价，50%组织感染率(TCID50)为10-6。
3.药物和试剂 (1)黄芪总皂甙注射液(AS)：黄芪总皂甙由南京中医药大学中医药研究院从蒙古黄芪中提取，为淡黄色粉末，经鉴定为三萜类皂甙；参照文献[2]以黄芪甲甙(中国药品生物制品检定所出品)为标准测定，所提黄芪总皂甙中含26%的黄芪甲甙。以生理盐水溶解，调pH至7.4，0.45μm微孔滤膜过滤,得1mg/ml的AS，分装备用。(2)黄芪注射液(AI.4g/2ml).(3)试剂：对-硝基酚(p-NP)、对-硝基苯磷酸(p-NPP)，Hepes，EGTA，TritonX-100均购自Sigma公司，其余为国产分析纯。
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4.病毒感染及分组给药 BALB/c小鼠随机分成4组。模型组(感染加生理盐水)，22只；AS组(感染加AS)，26只；AI组(感染加AI)，18只；对照组，18只。模型组、AS、AI组分别于实验当天每鼠腹腔注射0.1ml,2×104TCID50的CVB3m; 对照组每鼠腹腔注射0.1ml不含病毒的培养液.于病毒感染后开始，模型组及对照组小鼠每只每天腹腔注射生理盐水0.15ml，AS组小鼠则每只腹腔注射AS 0.15ml,AI组每只腹腔注射AI 0.15ml，各组小鼠均连续7天腹腔注射。
5.标本取材 于实验第8天,从小鼠眼眶取血,分离血清待检.取血后处死,取心脏中下1/3处的部分心肌,用10%福尔马林固定待用.取其余心室肌组织,-70℃保存备用。
6.观测指标
6.1统计小鼠死亡率.
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6.2心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I , cTnI)血清cTnI含量,采用本室建立的改良Bodor夹心ELISA法测定[3],浓度单位为μg/L.
6.3病理组织学检查 10%福尔马林固定的心肌用石蜡包埋后作连续切片,HE染色,光镜下观察心肌病理改变,并参考文献方法[4]计算心肌病理组织学积分.每张切片计算其中心肌坏死及炎症面积与整个心肌切片面积的比值:无病变计0分,病变面积75%计4分。
6.4肌浆网钙泵(Sarco/Endoplasmic Ca-ATP ase ,SERCA)活力 心肌SERCA活力,采用本室改良建立的 p-NPP法测定[5].反映体系含心肌匀浆,20mmol/L Hepes pH7.4 . 1mmol/L Mgcl2, 1mmol/L EGTA,0.01‰ TritonX-100, 100mmol/L KCL .加或不加0.8mmol/L CaCl2,预温 37℃ 10min加 10mmol/L
p-NPP37℃反应30min.结束时用冷缓冲液终止反应,在波长410nm处测定p-NP生成量,与标准 p-NP浓度曲线比较,并与时间及组织蛋白量相比即得SERCA活力单位(μmol/g pro.min).
7.统计学分析 均数组间比较用t检验.率的比较用х2检验,cTnI数据用秩和检验。, http://www.100md.com(陆曙 张寄南 杨笛 徐晋丹 陈相健 方五旺 马文珠)