甲状腺疾病患者促甲状腺素受体膜外区基因突变的研究(1)
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人促甲状腺素受体(human TSH receptor，hTSHR)存在于甲状腺滤泡细胞膜上，在生理情况下，与促甲状腺素(TSH)结合，调节甲状腺细胞的功能和生长，也是Graves病等自身免疫性甲状腺疾病(AITD)产生TSHR自身抗体(TSHRAb)的靶抗原[1]。有研究认为TSHR基因突变，可导致其结构的改变，引起TSHRAb的产生进而导致AITD的发病[2]。另外，TSHR基因突变还是高功能甲状腺腺瘤和结节发病的主要因素[3]。因此认识TSHR基因序列、氨基酸序列和有无基因突变已成为深入研究甲状腺疾病的重要环节。本课题从手术切除的甲状腺组织中提取总RNA，经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增全长TSHR膜外区基因，对正常引产胎儿进行了TSHR基因序列分析，并检测了Graves病，桥本氏甲状腺炎和结节性甲状腺肿患者甲状腺组织的全长TSHR膜外区，以了解是否存在基因突变。
对象与方法
, 百拇医药
一、对象
1.正常人组：4例，为中期引产的正常胎儿，男1例、女3例，胎龄6--8月。父母双方无甲状腺疾病史及家族史。
2.甲状腺疾病组：27例，男3例、女24例，年龄：46.1±12.2岁。均经临床症状、体征、实验室检查、B超或核素检查及甲状腺组织病理确诊。
(1).Graves病组：12例，其中3例因为病史较长，病理组织学上有较多的淋巴细胞侵润，并有淋巴细胞生发中心出现，有向桥本氏甲状腺炎转化的表现。均经抗甲状腺药物(他巴唑)和卢戈氏液控制病情后，行甲状腺次全切除术。
(2).桥本氏甲状腺炎组：4例，其中伴甲状腺功能亢进者2例，甲状腺功能正常者2例。行肿物切除术或一侧腺叶切除术。。
(3).结节性甲状腺肿组：11例，甲状腺功能均正常。行肿物切除术。
, http://www.100md.com
二、材料
ABI391型DNA合成仪和2400型PCR扩增仪购自美国Perkin-Elmer 公司；CEQ2000型DNA测序仪和四色荧光标记DNA循环测序试剂盒购自美国Beckman Coulter公司；TRLzol试剂，cDNA第一链合成试剂盒和PCR DNA扩增试剂盒购自美国GIBCO BRL公司。
三、方法
1.PCR引物设计：参照Nagayama Y等[4]报告的hTSHR cDNA序列自行设计并合成引物。扩增长为1300碱基对(bp)的hTSHR膜外区cDNA引物为：上游引物P1 5'-ACGAATTCAGGATGGAGAAATAGCCCCGAGT-3'(60-90)；下游引物P3R 5'-TTACACAATTCTCAGGAACTTGTAGCC-3'(1337-1363)。使得扩增的PCR产物包括了全长TSHR膜外区cDNA，其长度为1304bp。引物经Oligo 5.0 计算机引物设计软件(美国National Biosciences公司)检测符合PCR要求。
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2.甲状腺组织cDNA第一链的合成：取手术切除的甲状腺组织，以TRIzol试剂一步法提取了甲状腺总RNA，再按cDNA合成试剂盒方法以随机引物和特异下游引物法逆转录合成cDNA第一链。
3.PCR扩增hTSHR膜外区cDNA：以逆转录甲状腺cDNA第一链为模板，在DNA自动扩增仪上进行PCR，同时设阴性对照(不加样品总RNA，其余成分不变)和阳性对照(逆转录试剂盒提供的对照RNA和上下游引物)。反应体系为10×PCR缓冲液5μl，50mM Mgcl2 1.5μl，10mM dNTP 混和物 1μl，上、下游引物(10pmol/μl)各1.25μl，模板(cDNA第一链) 2μl， Taq DNA聚合酶(5u/μl) 0.5μl，以超纯水补至总体积为50μl。条件为94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，反应共35个循环，后25个循环72℃延伸每个循环递增5秒；最后72℃延伸7分钟后4℃保温。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，0.5μg/ml溴化乙锭(EB)染色，, 百拇医药(张遵城 方佩华 周津东)
人促甲状腺素受体(human TSH receptor，hTSHR)存在于甲状腺滤泡细胞膜上，在生理情况下，与促甲状腺素(TSH)结合，调节甲状腺细胞的功能和生长，也是Graves病等自身免疫性甲状腺疾病(AITD)产生TSHR自身抗体(TSHRAb)的靶抗原[1]。有研究认为TSHR基因突变，可导致其结构的改变，引起TSHRAb的产生进而导致AITD的发病[2]。另外，TSHR基因突变还是高功能甲状腺腺瘤和结节发病的主要因素[3]。因此认识TSHR基因序列、氨基酸序列和有无基因突变已成为深入研究甲状腺疾病的重要环节。本课题从手术切除的甲状腺组织中提取总RNA，经逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增全长TSHR膜外区基因，对正常引产胎儿进行了TSHR基因序列分析，并检测了Graves病，桥本氏甲状腺炎和结节性甲状腺肿患者甲状腺组织的全长TSHR膜外区，以了解是否存在基因突变。
对象与方法
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一、对象
1.正常人组：4例，为中期引产的正常胎儿，男1例、女3例，胎龄6--8月。父母双方无甲状腺疾病史及家族史。
2.甲状腺疾病组：27例，男3例、女24例，年龄：46.1±12.2岁。均经临床症状、体征、实验室检查、B超或核素检查及甲状腺组织病理确诊。
(1).Graves病组：12例，其中3例因为病史较长，病理组织学上有较多的淋巴细胞侵润，并有淋巴细胞生发中心出现，有向桥本氏甲状腺炎转化的表现。均经抗甲状腺药物(他巴唑)和卢戈氏液控制病情后，行甲状腺次全切除术。
(2).桥本氏甲状腺炎组：4例，其中伴甲状腺功能亢进者2例，甲状腺功能正常者2例。行肿物切除术或一侧腺叶切除术。。
(3).结节性甲状腺肿组：11例，甲状腺功能均正常。行肿物切除术。
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二、材料
ABI391型DNA合成仪和2400型PCR扩增仪购自美国Perkin-Elmer 公司；CEQ2000型DNA测序仪和四色荧光标记DNA循环测序试剂盒购自美国Beckman Coulter公司；TRLzol试剂，cDNA第一链合成试剂盒和PCR DNA扩增试剂盒购自美国GIBCO BRL公司。
三、方法
1.PCR引物设计：参照Nagayama Y等[4]报告的hTSHR cDNA序列自行设计并合成引物。扩增长为1300碱基对(bp)的hTSHR膜外区cDNA引物为：上游引物P1 5'-ACGAATTCAGGATGGAGAAATAGCCCCGAGT-3'(60-90)；下游引物P3R 5'-TTACACAATTCTCAGGAACTTGTAGCC-3'(1337-1363)。使得扩增的PCR产物包括了全长TSHR膜外区cDNA，其长度为1304bp。引物经Oligo 5.0 计算机引物设计软件(美国National Biosciences公司)检测符合PCR要求。
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2.甲状腺组织cDNA第一链的合成：取手术切除的甲状腺组织，以TRIzol试剂一步法提取了甲状腺总RNA，再按cDNA合成试剂盒方法以随机引物和特异下游引物法逆转录合成cDNA第一链。
3.PCR扩增hTSHR膜外区cDNA：以逆转录甲状腺cDNA第一链为模板，在DNA自动扩增仪上进行PCR，同时设阴性对照(不加样品总RNA，其余成分不变)和阳性对照(逆转录试剂盒提供的对照RNA和上下游引物)。反应体系为10×PCR缓冲液5μl，50mM Mgcl2 1.5μl，10mM dNTP 混和物 1μl，上、下游引物(10pmol/μl)各1.25μl，模板(cDNA第一链) 2μl， Taq DNA聚合酶(5u/μl) 0.5μl，以超纯水补至总体积为50μl。条件为94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，58℃退火1分钟，72℃延伸3分钟，反应共35个循环，后25个循环72℃延伸每个循环递增5秒；最后72℃延伸7分钟后4℃保温。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，0.5μg/ml溴化乙锭(EB)染色，, 百拇医药(张遵城 方佩华 周津东)