hTPO抗原决定簇基因的原核表达及初步临床应用(1)
身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease，AITD)是一类临床常见病，主要包括Graves病(GD)、桥本氏甲状腺炎(HT)和特发性粘液性水肿。
人甲状腺过氧化物酶(human thyroid peroxidase ,hTPO) 能催化碘的活化、甲状腺球蛋白上酪氨酸残基的碘化及碘化酪氨酸残基的耦联，最终产生T3、T4。在病理状态下，hTPO还是一种重要的抗原活性物质 。AITD患者血清中TPOAb (即TMAb，现在国际上多称之为TPOAb) 的水平与AITD的活动程度具有相关性，对于AITD，尤其是桥本氏甲状腺炎的诊断、疗效观察以及预后判断具有重要价值。hTPO对于AITD致病机理的研究也有非常重要的意义。有研究表明TPOAb可与补体结合；TPOAb中的IgG1亚群可影响T细胞介导对人甲状腺细胞的细胞毒作用(1)，由此推测其很可能与AITD 患者甲状腺细胞的破坏有直接关系。
临床上应用的TMAb/TPOAb的检测方法有血凝法，免疫荧光法，补体结合法和竞争蛋白结合法，免疫放射分析和竞争RIA。过去，国内外所用测定TMAb方法中，TM来源多从人甲状腺组织中提取，检测中易存在其它甲状腺自身抗原(主要是TG)的干扰。1987年，Libert(2)等人报告了hTPO cDNA的核甘酸序列，国外开始试用基因重组技术解决TPO的来源。重组TPO来源稳定，既具有免疫学活性又不含其它甲状腺抗原，使检测结果更为可靠。
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本实验室于1997年在《中华内分泌代谢杂志》上报道了hTPO抗原决定簇基因的克隆和序列分析(3)。本研究内容是上述工作的延续，将hTPO抗原决定簇基因(1702-2622，编号相对于起始密码子)插入表达载体pGEX-4T-3，构建重组表达质粒并在原核系统中大量表达，表达产物经纯化及鉴定后初步应用于临床，包括用于建立测定TPOAb的ELISA方法和用于探讨AITD的发病机制。
材料与方法
一、材料
1.主要试剂：限制性内切酶，T4-DNA连接酶等为GIBCO BRL公司产品。碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG为SIGMA公司产品。测序试剂盒为PE公司产品。GST融合蛋白纯化试剂盒，凝血酶购自Pharmacia公司。实验中所用缓冲液PBS、TBS及TBST等均按文献(4)配方，实验用水为超纯去离子水。
2.菌株、质粒： E.coli BL21，pGEX-4T-3购自Pharmacia公司。E.coli DH5α为天津医科大学东院免疫室赠送。hTPO抗原决定簇基因克隆质粒pESY 101为本室构建。
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3. 血清：正常人血清:310例，来源：天津市健康查体人群。AITD患者血清：GD组17例, HT组12例,来源：本院收治患者，其中7例HT，5例GD有病理确证诊断。
二、方法
1.hTPO抗原决定簇基因重组表达质粒的构建
质粒pESY101及载体pGEX-4T-3分别用限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ双酶切，产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳，分别回收0.9 kb片段(hTPO抗原决定簇基因)和4.9 kb片段(载体DNA)。以T4 DNA连接酶催化hTPO基因片段与载体DNA的连接反应。连接产物按新鲜氯化钙法转化 E.coli DH5α感受态细胞。转化菌在SOB培养基37℃培养过夜，挑取生长良好的单菌落增菌，PEG法提取质粒依次用酶切、PCR、接口处测序方法鉴定。
2.重组hTPO抗原决定簇基因在原核细胞中的表达
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经过鉴定的重组表达质粒转化表达型菌株E.coli BL21。转化后细菌37℃培养至OD600达到0.5时加入诱导剂IPTG，在不同诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间的条件下进行诱导表达。诱导后细菌经PBS缓冲液漂洗三次，于冰浴中低能量超声粉碎,分别保存上清和沉淀。按常规方法进行SDS-PAGE，检测表达结果。
3.表达产物的纯化与定量
按GST(谷光甘肽巯基转移酶)融合蛋白纯化试剂盒方法，在碎菌上清中加亲和层析柱填料(含谷光甘肽配基，可与GST结合),根据亲和层析原理，以GST融合蛋白形式存在的表达产物被结合在层析柱填料上，用10倍柱床体积的PBS漂洗3次，再加2倍柱床体积的还原型谷光甘肽(浓度10M，pH8.0)洗脱表达产物。表达产物的定量采用考马斯亮蓝法。将牛血清白蛋白(BSA)配成1mg/ml的标准溶液。按文献(5)方法配制考马斯亮蓝染料溶液(CBG)。在酶标板上各孔分别加不同稀释度的BSA标准溶液或待测样品20μl,再加200μl CBG，混匀。设定酶标仪工作参数,再输入每一个标准点所对应的蛋白浓度值,酶标仪即可制定标准曲线并将酶标板上各孔测得的OD值换算成浓度值。, 百拇医药(何红鹏)
人甲状腺过氧化物酶(human thyroid peroxidase ,hTPO) 能催化碘的活化、甲状腺球蛋白上酪氨酸残基的碘化及碘化酪氨酸残基的耦联，最终产生T3、T4。在病理状态下，hTPO还是一种重要的抗原活性物质 。AITD患者血清中TPOAb (即TMAb，现在国际上多称之为TPOAb) 的水平与AITD的活动程度具有相关性，对于AITD，尤其是桥本氏甲状腺炎的诊断、疗效观察以及预后判断具有重要价值。hTPO对于AITD致病机理的研究也有非常重要的意义。有研究表明TPOAb可与补体结合；TPOAb中的IgG1亚群可影响T细胞介导对人甲状腺细胞的细胞毒作用(1)，由此推测其很可能与AITD 患者甲状腺细胞的破坏有直接关系。
临床上应用的TMAb/TPOAb的检测方法有血凝法，免疫荧光法，补体结合法和竞争蛋白结合法，免疫放射分析和竞争RIA。过去，国内外所用测定TMAb方法中，TM来源多从人甲状腺组织中提取，检测中易存在其它甲状腺自身抗原(主要是TG)的干扰。1987年，Libert(2)等人报告了hTPO cDNA的核甘酸序列，国外开始试用基因重组技术解决TPO的来源。重组TPO来源稳定，既具有免疫学活性又不含其它甲状腺抗原，使检测结果更为可靠。
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本实验室于1997年在《中华内分泌代谢杂志》上报道了hTPO抗原决定簇基因的克隆和序列分析(3)。本研究内容是上述工作的延续，将hTPO抗原决定簇基因(1702-2622，编号相对于起始密码子)插入表达载体pGEX-4T-3，构建重组表达质粒并在原核系统中大量表达，表达产物经纯化及鉴定后初步应用于临床，包括用于建立测定TPOAb的ELISA方法和用于探讨AITD的发病机制。
材料与方法
一、材料
1.主要试剂：限制性内切酶，T4-DNA连接酶等为GIBCO BRL公司产品。碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG为SIGMA公司产品。测序试剂盒为PE公司产品。GST融合蛋白纯化试剂盒，凝血酶购自Pharmacia公司。实验中所用缓冲液PBS、TBS及TBST等均按文献(4)配方，实验用水为超纯去离子水。
2.菌株、质粒： E.coli BL21，pGEX-4T-3购自Pharmacia公司。E.coli DH5α为天津医科大学东院免疫室赠送。hTPO抗原决定簇基因克隆质粒pESY 101为本室构建。
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3. 血清：正常人血清:310例，来源：天津市健康查体人群。AITD患者血清：GD组17例, HT组12例,来源：本院收治患者，其中7例HT，5例GD有病理确证诊断。
二、方法
1.hTPO抗原决定簇基因重组表达质粒的构建
质粒pESY101及载体pGEX-4T-3分别用限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ双酶切，产物经低熔点琼脂糖凝胶电泳，分别回收0.9 kb片段(hTPO抗原决定簇基因)和4.9 kb片段(载体DNA)。以T4 DNA连接酶催化hTPO基因片段与载体DNA的连接反应。连接产物按新鲜氯化钙法转化 E.coli DH5α感受态细胞。转化菌在SOB培养基37℃培养过夜，挑取生长良好的单菌落增菌，PEG法提取质粒依次用酶切、PCR、接口处测序方法鉴定。
2.重组hTPO抗原决定簇基因在原核细胞中的表达
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经过鉴定的重组表达质粒转化表达型菌株E.coli BL21。转化后细菌37℃培养至OD600达到0.5时加入诱导剂IPTG，在不同诱导剂浓度、诱导温度和诱导时间的条件下进行诱导表达。诱导后细菌经PBS缓冲液漂洗三次，于冰浴中低能量超声粉碎,分别保存上清和沉淀。按常规方法进行SDS-PAGE，检测表达结果。
3.表达产物的纯化与定量
按GST(谷光甘肽巯基转移酶)融合蛋白纯化试剂盒方法，在碎菌上清中加亲和层析柱填料(含谷光甘肽配基，可与GST结合),根据亲和层析原理，以GST融合蛋白形式存在的表达产物被结合在层析柱填料上，用10倍柱床体积的PBS漂洗3次，再加2倍柱床体积的还原型谷光甘肽(浓度10M，pH8.0)洗脱表达产物。表达产物的定量采用考马斯亮蓝法。将牛血清白蛋白(BSA)配成1mg/ml的标准溶液。按文献(5)方法配制考马斯亮蓝染料溶液(CBG)。在酶标板上各孔分别加不同稀释度的BSA标准溶液或待测样品20μl,再加200μl CBG，混匀。设定酶标仪工作参数,再输入每一个标准点所对应的蛋白浓度值,酶标仪即可制定标准曲线并将酶标板上各孔测得的OD值换算成浓度值。, 百拇医药(何红鹏)