hTPO抗原决定簇基因的原核表达及初步临床应用(2)
4. 表达产物的鉴定
表达产物分子量的测定采用SDS-PAGE方法。首先，按常规方法进行低分子量蛋白标准与表达产物的 SDS-PAGE， 根据Weber公式：
Sp:样品迁移距离S:指示剂迁移距离
G1:染色前分离胶长度 G2:脱色后分离胶长度
计算各条蛋白带的相对迁移率(Rf)，由蛋白标准各条带的分子量(MW)及其迁移率,建立lgMW与Rf 间的回归方程,根据表达产物的迁移率计算其分子量。
表达产物免疫学活性的鉴定采用ELISA方法。分别用纯化的GST-TPO及GST 2μg/孔，4℃过夜包被酶标板。TBST洗板3次。加封闭液(含3%BSA的TBST),37℃温育1小时。漂洗后加血清100ul,37℃ 1小时。洗板，加1:20,000倍稀释的碱性磷酸酶标记羊抗人IgG,37℃ 1小时。漂洗，加对硝基苯基磷酸二钠显色,室温放置45分钟后测OD405。
5.表达产物初步临床应用
(1)建立TPOAb测定的ELISA方法按上述ELISA方法的步骤检测310例正常人，17例GD，12例HT患者及37例已知TMAb结果(RIA方法测定)血清TPO抗体。
(2)观察AITD患者血清TPOAb水平与甲状腺组织损伤的相关性收集我院1999年12月至2000年7月收治的AITD患者甲状腺组织及相应患者的血清。用ELISA方法测定血清TPOAb。甲状腺组织切片和细针穿刺涂片分别采用HE染色观察损伤程度和免疫化学染色检测HLA-DR抗原表达及树突状细胞浸润。
结 果
1.hTPO抗原决定簇基因重组表达质粒的鉴定
(1) 酶切分析由于EcoRⅠ、SalⅠ酶切位点为目的基因(hTPO抗原决定簇基因)的克隆位点，SacⅠ酶切位点经检索仅在目的基因上存在，重组表达质粒经上述三种内切酶分别单酶切后均成为线性，分子量为5.8kb，相当于目的基因与载体DNA分子量之和(0.9kb +4.9kb)。经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切，出现0.9kb 、4.9kb两条带，0.9kb带相当于目的基因位置、4.9kb带相当于载体DNA位置。
(2)PCR分析重组表达质粒用hTPO特异性引物扩增后，PCR产物大小为0.9kb，与hTPO抗原决定簇基因大小相符。
(3)接口处测序利用正、反向引物对重组表达质粒克隆接口进行测序分析。ABI PRISMTM310 Genetic Analyzer测序得到的碱基序列与理论对比表明接口处序列正确，未改变阅读框架。
2.hTPO抗原决定簇基因在原核细胞中的表达重组质粒转化菌，空质粒转化菌及未转化空菌经诱导后碎菌上清液SDS-PAGE，与未转化空菌比较，可见重组表达质粒转化菌在分子量接近67KD处有一明显的外源蛋白带，而空质粒转化菌则在分子量接近30KD处出现一明显外源蛋白带，见图1。, http://www.100md.com(何红鹏)
表达产物分子量的测定采用SDS-PAGE方法。首先，按常规方法进行低分子量蛋白标准与表达产物的 SDS-PAGE， 根据Weber公式：
Sp:样品迁移距离S:指示剂迁移距离
G1:染色前分离胶长度 G2:脱色后分离胶长度
计算各条蛋白带的相对迁移率(Rf)，由蛋白标准各条带的分子量(MW)及其迁移率,建立lgMW与Rf 间的回归方程,根据表达产物的迁移率计算其分子量。
表达产物免疫学活性的鉴定采用ELISA方法。分别用纯化的GST-TPO及GST 2μg/孔，4℃过夜包被酶标板。TBST洗板3次。加封闭液(含3%BSA的TBST),37℃温育1小时。漂洗后加血清100ul,37℃ 1小时。洗板，加1:20,000倍稀释的碱性磷酸酶标记羊抗人IgG,37℃ 1小时。漂洗，加对硝基苯基磷酸二钠显色,室温放置45分钟后测OD405。
5.表达产物初步临床应用
(1)建立TPOAb测定的ELISA方法按上述ELISA方法的步骤检测310例正常人，17例GD，12例HT患者及37例已知TMAb结果(RIA方法测定)血清TPO抗体。
(2)观察AITD患者血清TPOAb水平与甲状腺组织损伤的相关性收集我院1999年12月至2000年7月收治的AITD患者甲状腺组织及相应患者的血清。用ELISA方法测定血清TPOAb。甲状腺组织切片和细针穿刺涂片分别采用HE染色观察损伤程度和免疫化学染色检测HLA-DR抗原表达及树突状细胞浸润。
结 果
1.hTPO抗原决定簇基因重组表达质粒的鉴定
(1) 酶切分析由于EcoRⅠ、SalⅠ酶切位点为目的基因(hTPO抗原决定簇基因)的克隆位点，SacⅠ酶切位点经检索仅在目的基因上存在，重组表达质粒经上述三种内切酶分别单酶切后均成为线性，分子量为5.8kb，相当于目的基因与载体DNA分子量之和(0.9kb +4.9kb)。经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切，出现0.9kb 、4.9kb两条带，0.9kb带相当于目的基因位置、4.9kb带相当于载体DNA位置。
(2)PCR分析重组表达质粒用hTPO特异性引物扩增后，PCR产物大小为0.9kb，与hTPO抗原决定簇基因大小相符。
(3)接口处测序利用正、反向引物对重组表达质粒克隆接口进行测序分析。ABI PRISMTM310 Genetic Analyzer测序得到的碱基序列与理论对比表明接口处序列正确，未改变阅读框架。
2.hTPO抗原决定簇基因在原核细胞中的表达重组质粒转化菌，空质粒转化菌及未转化空菌经诱导后碎菌上清液SDS-PAGE，与未转化空菌比较，可见重组表达质粒转化菌在分子量接近67KD处有一明显的外源蛋白带，而空质粒转化菌则在分子量接近30KD处出现一明显外源蛋白带，见图1。, http://www.100md.com(何红鹏)