hTPO抗原决定簇基因的原核表达及初步临床应用(4)
表达产物的定量的原理是CBG与蛋白质结合后在595nm处出现紫外吸收峰。纯化后融合蛋白的浓度为4mg/ml左右，产率约为10mg/l培养基。
4.表达产物的鉴定
(1) 融合蛋白的凝血酶裂解分析pGEX-4T-3系统表达的产物是一种融合蛋白，包括载体编码的GST和插入的目的基因编码的外源蛋白，在两者连接处有一个凝血酶识别位点。表达菌上清中的融合蛋白从层析柱洗脱后用凝血酶消化，裂解为两条带，其位置分别相当于hTPO片段及GST。融合蛋白结合在层析柱上用凝血酶消化，SDS-PAGE可见一条蛋白带，分子量在30～43KD间，相当于hTPO片段的大小。
(2)分子量的测定
Rf与LgMW间的直线回归方程LgMW=2.086-0.8297×Rf,r=0.9959. GST-TPO与TPO抗原决定簇片段的Rf值分别是0.359，0.615，代入回归方程，算得GST-TPO分子量为61.40KD，TPO片段分子量为37.65KD。
(3)免疫学活性的鉴定
分别以GST-TPO、 TPO片段、GST 为抗原包被酶标板，检测22例TMAb阳性病人及17例正常人血清TPOAb，结果以GST-TPO为抗原时，TMAb阳性病人与正常人比较差异有显著性(1=1.816，2=0.698，p<0.001)；以TPO片段为抗原时，两组比较差异也有显著性(1=1.421，2=0.730，p<0.001)；而以GST为抗原时，两组比较差异无显著性(1=0.887，2=0.768，p>0.05)
以上结果表明GST-TPO，TPO均能被TMAb识别，GST与TMAb无免疫交叉反应。
5.表达产物的初步临床应用
(1)建立检测血清TPOAb的ELISA方法
以GST-TPO为抗原，测定310例正常人，17例GD患者，12例HT患者血清TPOAb。正常值范围±2s为0.383～1.011 OD。以OD大于1.011为阳性，GD患者TPOAb阳性率52.94%(9/17)，HT患者TPOAb阳性率83.33%(10/12)。在GD组TPOAb阳性总的趋势是滴度较低，3例结果在1.01至1.2范围， 2例为明显强阳性(1.551、2.126)但均, http://www.100md.com(何红鹏)