hTPO抗原决定簇基因的原核表达及初步临床应用(6)
注：在HLA-DR、S-100免疫化学染色中“-”表示阴性、“+”表示散在、“++”表示成丛。TPOAb测定OD值大于1.011为阳性。
讨 论
在重组DNA技术中，重组表达质粒的正确构建是一个非常关键的步骤。基因的表达包括转录、翻译和翻译后修饰。外源基因的正确翻译需要外源基因与载体质粒的正确连接及起始密码子和终止密码子的存在。由于密码子的“无标点符号”性，在基因重组时只要有一个碱基错位，就会引起整个阅读框的改变，造成外源基因的不表达、表达不能终止或即使表达，其产物也不是所需蛋白的严重后果。本研究中，起始密码子和终止密码子均为载体质粒携带，TPO基因片段插入后接口处测序结果表明基因阅读框正确。TPO基因的正确克隆是下一步进行诱导表达TPO抗原决定簇片段的前提。
本研究采用pGEX-4T-3融合蛋白表达系统，表达产物是谷胱甘肽巯基转移酶(GST)和hTPO抗原决定簇的融合体，有较强的免疫学活性，可作为TPOAb ELISA检测方法的抗原，已初步用于临床。1升培养基获得的表达产物可以包被5000个酶标板孔，解决了提取TM方法的甲状腺来源受限且易存在其它甲状腺抗原污染的问题。有研究表明hTPO抗原决定簇位点与酶活性位点可能位于同一区域(6)。体外实验证明TPO抗体可抑制TPO的酶活性(7)。本研究结果表明HT患者血清TPO抗体滴度明显高于GD患者， HT患者甲状腺功能低下可能在一定程度上是由于体内TPO抗体的存在封闭了酶的活性位点，使其不能发挥作用，T3、T4合成减少。本研究发现随甲状腺组织淋巴细胞浸润的增加血清TPO抗体滴度呈增加趋势，提示TPO抗体产生可能是甲状腺组织破坏的结果或TPO抗体的存在可破坏甲状腺组织。
, 百拇医药
HLA-Ⅱ类基因包括DR、DP、DQ三个亚区，其编码的蛋白分子主要存在于树突状细胞等抗原递呈细胞表面，正常情况下，甲状腺组织中极少见到树突状细胞，甲状腺滤泡上皮不表达HLA-DR抗原(8)。在本研究中树突状细胞的浸润主要出现在甲状腺组织破坏程度较重的HT标本，大部分AITD患者甲状腺滤泡上皮细胞HLA-DR抗原阳性，尤其在一些HT-O型患者甲状腺穿刺涂片可见HLA-DR阳性上皮细胞成丛存在。树突状细胞和异常表达HLA-DR抗原的甲状腺滤泡上皮可能发挥其抗原递呈作用，引发一系列细胞免疫和体液免疫反应。尤其在甲状腺滤泡上皮表面既有TPO分子又有能够将TPO递呈给T细胞的HLA-DR分子表达，使免疫反应易于发生，对于甲状腺细胞的免疫损伤可能有非常重要的意义。
参考文献
1. Metcalfe-RA et al.Analysis of antibody-dependent cell-mediate cytotoxicity in autoimmune thyroid disease，Autoimmunity，1997；25(2)：65-72.
, 百拇医药
2. F.Libert et al. Nucleic Acids Res ,1987;15:6735.
3.李进,余拥军,方佩华等.人甲状腺过氧化物酶抗原决定簇的基因克隆与序列分析，中华内分泌代谢杂志 1997;13(3):158-161
4.Sambrook et al，1989 Moleculer Cloning：A Laboratory Manual 2nD、Cold Spring Harbor Laboratory Press。
5.《精编分子生物学实验指南》科学出版社，1998年，第一版。
6.Nakajima Y，et al. Structure-activity analysis of microsomal antigen/thyroid peroxidase. Mol Cell Endocrinol，1987；58：15-23。
7.Okamoto Y，et al.Thyroid peroxidase activity -inhibiting immunoglobulins in patients with autoimmune thyroid disease， J Clin Endocrinol Metab，1989；68：730-734。
8.江昌新，谭郁彬，方佩华等.自身免疫性甲状腺疾病免疫活性细胞的病理学研究.中华内分泌代谢杂志，1998；14(3)：151-154., http://www.100md.com(何红鹏)
讨 论
在重组DNA技术中，重组表达质粒的正确构建是一个非常关键的步骤。基因的表达包括转录、翻译和翻译后修饰。外源基因的正确翻译需要外源基因与载体质粒的正确连接及起始密码子和终止密码子的存在。由于密码子的“无标点符号”性，在基因重组时只要有一个碱基错位，就会引起整个阅读框的改变，造成外源基因的不表达、表达不能终止或即使表达，其产物也不是所需蛋白的严重后果。本研究中，起始密码子和终止密码子均为载体质粒携带，TPO基因片段插入后接口处测序结果表明基因阅读框正确。TPO基因的正确克隆是下一步进行诱导表达TPO抗原决定簇片段的前提。
本研究采用pGEX-4T-3融合蛋白表达系统，表达产物是谷胱甘肽巯基转移酶(GST)和hTPO抗原决定簇的融合体，有较强的免疫学活性，可作为TPOAb ELISA检测方法的抗原，已初步用于临床。1升培养基获得的表达产物可以包被5000个酶标板孔，解决了提取TM方法的甲状腺来源受限且易存在其它甲状腺抗原污染的问题。有研究表明hTPO抗原决定簇位点与酶活性位点可能位于同一区域(6)。体外实验证明TPO抗体可抑制TPO的酶活性(7)。本研究结果表明HT患者血清TPO抗体滴度明显高于GD患者， HT患者甲状腺功能低下可能在一定程度上是由于体内TPO抗体的存在封闭了酶的活性位点，使其不能发挥作用，T3、T4合成减少。本研究发现随甲状腺组织淋巴细胞浸润的增加血清TPO抗体滴度呈增加趋势，提示TPO抗体产生可能是甲状腺组织破坏的结果或TPO抗体的存在可破坏甲状腺组织。
, 百拇医药
HLA-Ⅱ类基因包括DR、DP、DQ三个亚区，其编码的蛋白分子主要存在于树突状细胞等抗原递呈细胞表面，正常情况下，甲状腺组织中极少见到树突状细胞，甲状腺滤泡上皮不表达HLA-DR抗原(8)。在本研究中树突状细胞的浸润主要出现在甲状腺组织破坏程度较重的HT标本，大部分AITD患者甲状腺滤泡上皮细胞HLA-DR抗原阳性，尤其在一些HT-O型患者甲状腺穿刺涂片可见HLA-DR阳性上皮细胞成丛存在。树突状细胞和异常表达HLA-DR抗原的甲状腺滤泡上皮可能发挥其抗原递呈作用，引发一系列细胞免疫和体液免疫反应。尤其在甲状腺滤泡上皮表面既有TPO分子又有能够将TPO递呈给T细胞的HLA-DR分子表达，使免疫反应易于发生，对于甲状腺细胞的免疫损伤可能有非常重要的意义。
参考文献
1. Metcalfe-RA et al.Analysis of antibody-dependent cell-mediate cytotoxicity in autoimmune thyroid disease，Autoimmunity，1997；25(2)：65-72.
, 百拇医药
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4.Sambrook et al，1989 Moleculer Cloning：A Laboratory Manual 2nD、Cold Spring Harbor Laboratory Press。
5.《精编分子生物学实验指南》科学出版社，1998年，第一版。
6.Nakajima Y，et al. Structure-activity analysis of microsomal antigen/thyroid peroxidase. Mol Cell Endocrinol，1987；58：15-23。
7.Okamoto Y，et al.Thyroid peroxidase activity -inhibiting immunoglobulins in patients with autoimmune thyroid disease， J Clin Endocrinol Metab，1989；68：730-734。
8.江昌新，谭郁彬，方佩华等.自身免疫性甲状腺疾病免疫活性细胞的病理学研究.中华内分泌代谢杂志，1998；14(3)：151-154., http://www.100md.com(何红鹏)