维护血管内皮功能对心脑血管疾病的重要意义——系列研究之十七 通心络促脑缺血后血管内皮生长因子表达的实验研究
作者简介
董为伟 教授
现任重庆医科大学神经病学研究所所长，重庆医科大学一附院神经内科教授、博士生导师。兼任中华医学会神经专业委员会常务委员，中华医学会重庆分会神经科专业委员会主任委员，《中国神经精神疾病杂志》副主编等职。长期从事脑血管疾病的基础与临床研究，在国内外发表论文100余篇，出版专著2部，参编多部。获国家科技进步奖三等奖1项，卫生部科技进步二等奖1项，四川科技进步一等奖1项、三等奖4项。2001年获全国优秀科技工作者称号。
摘 要
目的：探讨通心络对大脑中动脉梗塞后血管内皮生长因子表达的影响。
方法：以线栓法制成大鼠右侧大脑中动脉梗塞模型(MCAO)，大鼠随机分为假手术对照组、MCAO组、通心络干预组。以免疫组织化学法及HE染色法分别检测脑组织病理学变化、VEGF阳性表达。
, 百拇医药
结果：大脑中动脉梗塞后，缺血区神经元变性、坏死、VEGF在半暗带有少量表达，经通心络干预后，VEGF大量表达。
结论：通心络可通过促VEGF表达上调，内皮细胞增殖，从而保护脑毛细血管内皮细胞，促进毛细血管新生。
目前，缺血性脑血管病的治疗以溶栓和神经保护治疗为主，无论是溶栓，还是神经保护治疗，目的均为恢复缺血区脑组织的血液供应，保护微血管、神经元，促进毛细血管新生，侧枝循环重建，神经结构重塑，使神经功能尽快尽可能恢复[1]。现已证实VEGF是血管内皮细胞特异性的促有丝分裂源，在病理情况下能促进内皮细胞分裂、增殖，使毛细血管新生[2]。因此，如何促进血管内皮细胞生长因子表达上调、促脑毛细血管新生，是当前脑缺血研究的热点[3]。迄今，在众多中药制剂中，尚无一种药物进行过这一方面的研究，通心络[4]是根据中医理论研制而成的含多种虫类中药的复方制剂，具有益气活血的功效，在脑血管病治疗中具有良好的效果，因此本文选择通心络进行研究，观察通心络对脑梗塞后VEGF表达的作用。
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材料与方法
主要仪器和试剂-70℃冰箱(Sharp，日本)；微量移液器(Gikson，法国)；BH-2型Okympus显微镜(日本)；彩色病理图像分析仪(日本)；VEGF兔多克隆抗体(Santa，美国)；SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德公司)。
实验动物模型：雄性健康的Wistar大鼠(250±20g)，采用右侧大脑中动脉线栓法梗塞模型(MCAO)。3.5%的水合氯醛腹腔麻醉(10mk/kg)，大鼠仰卧位固定，经颈部切开暴露左侧颈总动脉(CA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉颅外段(ICA)，在颈外动脉近颈总动脉分叉处剪一切口，将栓子(尼龙绳线，直径0.24mm，长20mm)向颈内动脉颅内方向插入(17.5～18)mm遇阻力而停止栓子头端即达大脑中动脉MCA起始部。将MCA起始部和ICA末端同时堵塞，同时用Zin氏夹，夹闭颈外动脉切口近端，缝合皮肤，栓塞即告完成。术后1小时，大鼠清醒，置单笼饲养观察，根据Berderson检查评级方法观察记录，大鼠术后爬行，不能走直线，而呈弯向栓塞血管对侧的环状爬行评为Ⅲ级。
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实验分组：实验大鼠被随机分成3组，每组6只。假手术对照组：手术过程及时间同其他组 但不阻断血供。MCAO组：每日0.05mk/kg生理盐水连续灌胃7天后行右侧大脑中动脉梗塞术，术后Ⅲ级大鼠入选，术后连续生理盐水灌胃7天。TCL干预组：每日2.5g/kgTXL连续灌胃7天后行MCAO手术，术后连续灌胃7天。
组织学观察
大鼠处死后取脑置10%福尔马林液固定，常规切片，HE染色，进行组织学观察。
VEGF蛋白表达的免疫组化染色
给予术后7天大鼠麻醉后行左心室灌注固定、取脑，4%PFA(多聚甲醛)外固定，10%蔗糖浸泡后，液氮连冻1分钟，恒冷切片机上在大脑中部作冠状切片 ，切片冷风吹干，纯丙酮室温固定20～30分钟。SABC法检测VEGF蛋白表达。蒸镏水洗，纯甲醇加H2O2至0.5% 室温浸泡30分钟 以灭活内源性过氧化物酶 蒸馏水洗3次 滴加正常山羊血清封闭液 室温20分钟。甩去多余液体 不洗。滴加适当稀释的—抗，4℃过液。0.1MPBS冼2分钟×3次，滴加生物素化山羊抗免IgG，37℃，20分钟，0.1MPBS洗2分钟×3次 滴加试剂SABC 20℃～37℃ 20分钟 0.1MPBS洗5分钟×4次，DAB显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤，脱水，透明，封片。显微镜观察。
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统计学分析：
所有资料以X±SD表示，两组间比较用t检验，P<0.05为有统计学差异，P<0.01认为具有显著性差异。
结 果
脑组织病理学改变
假手术对照组大鼠皮层组织细胞排列有序，细胞结构完整，细胞内可见NiSS小体，核清楚，组织间隙无异常。MCAO组：神经细胞呈缺血性改变，核消失，胞体增大，染色变淡，边缘不规则，核固缩，细胞周围水肿明显，组织结构疏松，水肿明显，呈海棉状。TXL干预组：缺血神经元数目减少，组织结构水肿减轻。
VEGF免疫组化及图像分析
假手术对照组无VEGF阳性神经元表达，MCAO组在缺血中心及周边区神经元、缺血侧软脑膜细胞、海马神经元均有VEGF弱表达；与MCAO组比较，TXL干预组上述部位有VEGF强阳性表达。
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讨 论
脑缺血后VEGF的表达与新血管生成
血管新生，即原有的血管又产生新的血管5。成年人器官，生理性的血管新生是很少见的。在月经期和妊娠期，女性生殖器官可以有血管新生。血管新生还可以发生在病理的情况下，例如缺血、炎症、伤口愈合等。血管新生是一个复杂的过程，包括一系列衔接非常准确的过程。脑血管闭塞以后，24小时内内皮细胞开始大量增殖，72小时缺血区有新生的毛细血管6。毛细血管新生的范围与程度直接关系到缺血边缘区血流的改善，影响神经元生理功能的恢复，从而决定了患者的预后1。新血管的形成来源于先前存在的血管的内皮细胞增殖，而内皮细胞增殖，有赖于VEGF的刺激7。VEGF是一种内皮细胞的特异性有丝分裂源，在体外可促进内皮细胞的生长，在体内可诱导血管生成1。这种作用主要是由于VEGF对血管内皮细胞的生长刺激作用和趋化作用，VEGF对内皮细胞的直接作用可能是通过激活细胞上的磷脂酶短暂地诱导Ca++释放而发生的8。VEGF为分泌性蛋白，作用于特异性受体，从而保护脑毛细血管内皮细胞，防止毛细血管消失，同时刺激内皮细胞增殖，血管新生，神经功能迅速恢复9、10、11。
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通心络对缺血后VEGF表达及新血管生成的作用
既往的研究发现，脑缺血后血流增加可诱导VEGF的大量表达12，既往的通心络试验表明，它具有降低脑缺血后血液黏度，降低脑血管阻力，增加脑缺血后脑血流量的作用4。因此从理论上讲，具有诱导VEGF表达的可行性，本实验进一步证实了上述观点。在对MCAO大鼠进行通心络预防性和治疗性给药后，大鼠脑组织缺血半暗带神经元、海马神经元及软脑膜、室管膜等有大量的VEGF表达，结果表明：通心络能够通过促进VEGF大量表达而保护脑毛细血管内皮细胞，防止毛细血管消失，促毛细血管新生，从而具有脑保护功能。
参考文献
1 Risau W. Mechanisms of angiogenesis. Nature19973866626671-674.
2 Issa RKrupinskiBuiny Tet ak.Vascukar endothekiak growth factor and its receptor KDR in human brain tissue after ischemic stroke.Lab Inveset1999794417-425
, 百拇医药
3 Krupinski JKumar PWang JMet ak.Prognostic vakue of bkood vessek density in ischemic stroke.Lancet19933428873742
4吴以岭主编 中医络病学说与心脑血管病，北京、中国科学技术出版社、2001。
5盖鲁粤 血管新生治疗(综述)，中华老年心血管病杂志，1999，1(1)：53-56。
6 Hugo JH Bemaudin MM Bekkaik A et ak. Hypoxia-induced vascukar endothekiak growth factor expression precedes neovascukarization after cerebrak ischemia. American joumak of pathokogy20001563965-976
, 百拇医药
7 Skevin M Krupinski J Skowik A et ak. Seriak measurement of vascukar endothekiak growth factor and TGF-b1 in serum of patients with acute ischemic stroke.Stroke 2000 3181863-1870.
8 Petty M Wettstin J.Brain Ekiments of cerebrak microvascukar ischemia. Research Review 2001 36123-34.
9 Jin KL Mao XO Greenberg D.Vascukar endothekiak growth factor Direct neuroprotective effect in vitro ischemia.PNAS2000971810242-10247.
, 百拇医药
10 Zhang ZGZhang Jiang Q et ak. VEGF enhances angiogensis and promotes bkood-barrrier keakage in the ischemic brain. J Ckin Invest 2000 1067829-838.
11 Robert WN. Mokicukar mechenism of ischemic neuronak injury. Annaks of Emergency Medicine 2000 365 483-506.
12 Hayashi T Abe k Suzuki H. Rapid induction of VEGF gene expression after transient middke cerebrak artery occkusion in rat brain infact. Stroke 1996 2710 1865-1873., http://www.100md.com(重庆医科大学第一附属医院神经内科 董为伟 石正洪)
董为伟 教授
现任重庆医科大学神经病学研究所所长，重庆医科大学一附院神经内科教授、博士生导师。兼任中华医学会神经专业委员会常务委员，中华医学会重庆分会神经科专业委员会主任委员，《中国神经精神疾病杂志》副主编等职。长期从事脑血管疾病的基础与临床研究，在国内外发表论文100余篇，出版专著2部，参编多部。获国家科技进步奖三等奖1项，卫生部科技进步二等奖1项，四川科技进步一等奖1项、三等奖4项。2001年获全国优秀科技工作者称号。
摘 要
目的：探讨通心络对大脑中动脉梗塞后血管内皮生长因子表达的影响。
方法：以线栓法制成大鼠右侧大脑中动脉梗塞模型(MCAO)，大鼠随机分为假手术对照组、MCAO组、通心络干预组。以免疫组织化学法及HE染色法分别检测脑组织病理学变化、VEGF阳性表达。
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结果：大脑中动脉梗塞后，缺血区神经元变性、坏死、VEGF在半暗带有少量表达，经通心络干预后，VEGF大量表达。
结论：通心络可通过促VEGF表达上调，内皮细胞增殖，从而保护脑毛细血管内皮细胞，促进毛细血管新生。
目前，缺血性脑血管病的治疗以溶栓和神经保护治疗为主，无论是溶栓，还是神经保护治疗，目的均为恢复缺血区脑组织的血液供应，保护微血管、神经元，促进毛细血管新生，侧枝循环重建，神经结构重塑，使神经功能尽快尽可能恢复[1]。现已证实VEGF是血管内皮细胞特异性的促有丝分裂源，在病理情况下能促进内皮细胞分裂、增殖，使毛细血管新生[2]。因此，如何促进血管内皮细胞生长因子表达上调、促脑毛细血管新生，是当前脑缺血研究的热点[3]。迄今，在众多中药制剂中，尚无一种药物进行过这一方面的研究，通心络[4]是根据中医理论研制而成的含多种虫类中药的复方制剂，具有益气活血的功效，在脑血管病治疗中具有良好的效果，因此本文选择通心络进行研究，观察通心络对脑梗塞后VEGF表达的作用。
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材料与方法
主要仪器和试剂-70℃冰箱(Sharp，日本)；微量移液器(Gikson，法国)；BH-2型Okympus显微镜(日本)；彩色病理图像分析仪(日本)；VEGF兔多克隆抗体(Santa，美国)；SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德公司)。
实验动物模型：雄性健康的Wistar大鼠(250±20g)，采用右侧大脑中动脉线栓法梗塞模型(MCAO)。3.5%的水合氯醛腹腔麻醉(10mk/kg)，大鼠仰卧位固定，经颈部切开暴露左侧颈总动脉(CA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉颅外段(ICA)，在颈外动脉近颈总动脉分叉处剪一切口，将栓子(尼龙绳线，直径0.24mm，长20mm)向颈内动脉颅内方向插入(17.5～18)mm遇阻力而停止栓子头端即达大脑中动脉MCA起始部。将MCA起始部和ICA末端同时堵塞，同时用Zin氏夹，夹闭颈外动脉切口近端，缝合皮肤，栓塞即告完成。术后1小时，大鼠清醒，置单笼饲养观察，根据Berderson检查评级方法观察记录，大鼠术后爬行，不能走直线，而呈弯向栓塞血管对侧的环状爬行评为Ⅲ级。
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实验分组：实验大鼠被随机分成3组，每组6只。假手术对照组：手术过程及时间同其他组 但不阻断血供。MCAO组：每日0.05mk/kg生理盐水连续灌胃7天后行右侧大脑中动脉梗塞术，术后Ⅲ级大鼠入选，术后连续生理盐水灌胃7天。TCL干预组：每日2.5g/kgTXL连续灌胃7天后行MCAO手术，术后连续灌胃7天。
组织学观察
大鼠处死后取脑置10%福尔马林液固定，常规切片，HE染色，进行组织学观察。
VEGF蛋白表达的免疫组化染色
给予术后7天大鼠麻醉后行左心室灌注固定、取脑，4%PFA(多聚甲醛)外固定，10%蔗糖浸泡后，液氮连冻1分钟，恒冷切片机上在大脑中部作冠状切片 ，切片冷风吹干，纯丙酮室温固定20～30分钟。SABC法检测VEGF蛋白表达。蒸镏水洗，纯甲醇加H2O2至0.5% 室温浸泡30分钟 以灭活内源性过氧化物酶 蒸馏水洗3次 滴加正常山羊血清封闭液 室温20分钟。甩去多余液体 不洗。滴加适当稀释的—抗，4℃过液。0.1MPBS冼2分钟×3次，滴加生物素化山羊抗免IgG，37℃，20分钟，0.1MPBS洗2分钟×3次 滴加试剂SABC 20℃～37℃ 20分钟 0.1MPBS洗5分钟×4次，DAB显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤，脱水，透明，封片。显微镜观察。
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统计学分析：
所有资料以X±SD表示，两组间比较用t检验，P<0.05为有统计学差异，P<0.01认为具有显著性差异。
结 果
脑组织病理学改变
假手术对照组大鼠皮层组织细胞排列有序，细胞结构完整，细胞内可见NiSS小体，核清楚，组织间隙无异常。MCAO组：神经细胞呈缺血性改变，核消失，胞体增大，染色变淡，边缘不规则，核固缩，细胞周围水肿明显，组织结构疏松，水肿明显，呈海棉状。TXL干预组：缺血神经元数目减少，组织结构水肿减轻。
VEGF免疫组化及图像分析
假手术对照组无VEGF阳性神经元表达，MCAO组在缺血中心及周边区神经元、缺血侧软脑膜细胞、海马神经元均有VEGF弱表达；与MCAO组比较，TXL干预组上述部位有VEGF强阳性表达。
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讨 论
脑缺血后VEGF的表达与新血管生成
血管新生，即原有的血管又产生新的血管5。成年人器官，生理性的血管新生是很少见的。在月经期和妊娠期，女性生殖器官可以有血管新生。血管新生还可以发生在病理的情况下，例如缺血、炎症、伤口愈合等。血管新生是一个复杂的过程，包括一系列衔接非常准确的过程。脑血管闭塞以后，24小时内内皮细胞开始大量增殖，72小时缺血区有新生的毛细血管6。毛细血管新生的范围与程度直接关系到缺血边缘区血流的改善，影响神经元生理功能的恢复，从而决定了患者的预后1。新血管的形成来源于先前存在的血管的内皮细胞增殖，而内皮细胞增殖，有赖于VEGF的刺激7。VEGF是一种内皮细胞的特异性有丝分裂源，在体外可促进内皮细胞的生长，在体内可诱导血管生成1。这种作用主要是由于VEGF对血管内皮细胞的生长刺激作用和趋化作用，VEGF对内皮细胞的直接作用可能是通过激活细胞上的磷脂酶短暂地诱导Ca++释放而发生的8。VEGF为分泌性蛋白，作用于特异性受体，从而保护脑毛细血管内皮细胞，防止毛细血管消失，同时刺激内皮细胞增殖，血管新生，神经功能迅速恢复9、10、11。
, 百拇医药
通心络对缺血后VEGF表达及新血管生成的作用
既往的研究发现，脑缺血后血流增加可诱导VEGF的大量表达12，既往的通心络试验表明，它具有降低脑缺血后血液黏度，降低脑血管阻力，增加脑缺血后脑血流量的作用4。因此从理论上讲，具有诱导VEGF表达的可行性，本实验进一步证实了上述观点。在对MCAO大鼠进行通心络预防性和治疗性给药后，大鼠脑组织缺血半暗带神经元、海马神经元及软脑膜、室管膜等有大量的VEGF表达，结果表明：通心络能够通过促进VEGF大量表达而保护脑毛细血管内皮细胞，防止毛细血管消失，促毛细血管新生，从而具有脑保护功能。
参考文献
1 Risau W. Mechanisms of angiogenesis. Nature19973866626671-674.
2 Issa RKrupinskiBuiny Tet ak.Vascukar endothekiak growth factor and its receptor KDR in human brain tissue after ischemic stroke.Lab Inveset1999794417-425
, 百拇医药
3 Krupinski JKumar PWang JMet ak.Prognostic vakue of bkood vessek density in ischemic stroke.Lancet19933428873742
4吴以岭主编 中医络病学说与心脑血管病，北京、中国科学技术出版社、2001。
5盖鲁粤 血管新生治疗(综述)，中华老年心血管病杂志，1999，1(1)：53-56。
6 Hugo JH Bemaudin MM Bekkaik A et ak. Hypoxia-induced vascukar endothekiak growth factor expression precedes neovascukarization after cerebrak ischemia. American joumak of pathokogy20001563965-976
, 百拇医药
7 Skevin M Krupinski J Skowik A et ak. Seriak measurement of vascukar endothekiak growth factor and TGF-b1 in serum of patients with acute ischemic stroke.Stroke 2000 3181863-1870.
8 Petty M Wettstin J.Brain Ekiments of cerebrak microvascukar ischemia. Research Review 2001 36123-34.
9 Jin KL Mao XO Greenberg D.Vascukar endothekiak growth factor Direct neuroprotective effect in vitro ischemia.PNAS2000971810242-10247.
, 百拇医药
10 Zhang ZGZhang Jiang Q et ak. VEGF enhances angiogensis and promotes bkood-barrrier keakage in the ischemic brain. J Ckin Invest 2000 1067829-838.
11 Robert WN. Mokicukar mechenism of ischemic neuronak injury. Annaks of Emergency Medicine 2000 365 483-506.
12 Hayashi T Abe k Suzuki H. Rapid induction of VEGF gene expression after transient middke cerebrak artery occkusion in rat brain infact. Stroke 1996 2710 1865-1873., http://www.100md.com(重庆医科大学第一附属医院神经内科 董为伟 石正洪)