如何筛选阻断致瘤病毒复制的药物
恶性肿瘤简称肿瘤的发生是多步骤、多因素作用，其中，病毒是肿瘤发生的重要环境因素之一。目前，已明确许多种病毒与人类肿瘤的发生有关。这些病毒的基因在细胞内复制、表达，通过多种不同的途径，导致细胞恶性转化，引起肿瘤的发生。随着病毒致瘤的机制逐渐被阐明，阻断致瘤病毒复制已成为抗肿瘤药物筛选的基本策略之一。
什么是致瘤病毒
致瘤病毒可以分为脱氧核糖核酸致瘤病毒和核糖核酸致瘤病毒。
与动物和人类肿瘤有关的脱氧核糖核酸致瘤病毒可以分为五大类：乳多空病毒类、腺病毒类、疱疹病毒类、乙型肝炎病毒类以及痘病毒类。其致癌作用发生在进入细胞后复制的早期阶段，相关的病毒癌基因多整合至宿主细胞的脱氧核糖核酸上。
核糖核酸致瘤病毒根据其潜伏期和体外转化细胞的能力，可以分为急性核糖核酸致瘤病毒和慢性核糖核酸致瘤病毒。急性核糖核酸病毒基因组在长期的进化过程中，由于部分结构基因被细胞癌基因取代，从而造成病毒复制功能缺陷，需要在辅助病毒的协助下，才能产生完整的病毒颗粒，是一种缺陷性逆转录病毒，具有体外转化能力强和致瘤潜伏期短的特点，其致瘤性与其基因组中癌基因有关。慢性核糖核酸致瘤病毒基因组中不带癌基因，其致瘤性是由于病毒整合到宿主细胞基因组内，由于病毒基因组内长末端重复序列内的病毒启动子或增强子使细胞内某些临近的原癌基因过度表达而引起癌变，具有潜伏期长、无体外转化细胞的能力或能力较弱。
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阻断致瘤病毒复制药物的筛选方法
多年来，病毒性疾病被认为是一种很难进行有选择性药物治疗的疾病，这是因为病毒的复制周期和正常细胞的代谢交织在一起，任何企图抑制病毒复制的药物，将注定同时要杀死或严重损害未感染的细胞。
随着作为药物治疗靶标的病毒特异性事件的阐明以及众多特异性抗病毒药物的出现，针对病毒感染进行有选择性药物治疗和阻断病毒复制而不伤害宿主成为可能。
病毒的复制可以粗略地分为10步：病毒吸附细胞、病毒和细胞融合、脱壳、早期转录、早期翻译、病毒基因组复制、晚期转录、晚期翻译、病毒装配和释放，所有这些步骤都可以作为药物干预的靶标。除了这些病毒特异性事件，还有许多参与病毒脱氧核糖核酸、核糖核酸或糖蛋白合成的酶，如次黄嘌呤核苷酸脱氢酶、S-腺苷高半胱氨酸水解酶、乳清酸核苷-5＇-磷酸脱酸酶、三磷酸胞苷合成酶等均可以作为抗病毒药物的靶标。
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如何阻断病毒与靶细胞的结合和融合？病毒感染的最初步骤就是病毒颗粒吸附于靶细胞，并通过与靶细胞受体结合而与靶细胞融合形成合胞体。抗体和疫苗可以阻断病毒与靶细胞的结合，如致瘤性EB病毒常引起鼻咽癌、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤等多种肿瘤。应用EB病毒膜抗原疫苗，可借助针对膜抗原的中和抗体或细胞免疫阻断EB病毒的原发性感染，在棉顶绒猴已成功地应用疫苗阻断EB病毒的感染。美国最近开发的AIDSVAX疫苗是用基因工程技术制造的，含两种亚型艾滋病病毒gpl20表面蛋白抗原的疫苗，可以产生针对病毒gpl20抗原的抗体，这种抗体能够阻断入侵艾滋病病毒与健康的CD4淋巴细胞结合，从而预防人体感染艾滋病病毒。此外，各种多聚阴离子物质还可通过干预病毒吸附于细胞表面而阻断病毒复制。例如，多聚硫酸脂，包括葡聚糖硫酸脂、糊精硫酸脂和聚乙烯醇硫酸脂等以及多磺酸盐。它们可以抑制脂包膜病毒，如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等与细胞结合。
如何干扰病毒的复制和表达？病毒进入细胞后，脱氧核糖核酸的复制需要核苷类化合物。因此，应用核苷类药物不仅可以抑制病毒复制的酶，而且可以竞争性地进入细胞后磷酸化，渗透、组合到病毒复制的脱氧核糖核酸中，阻断脱氧核糖核酸链的延长，抑制病毒复制。这方面的药物包括核苷类和开环核苷类，如被单纯疱疹病毒编码的胸苷激酶磷酸化成单磷酸形式或双磷酸形式，在细胞内激酶的作用下，进一步磷酸化成三磷酸形式，因此，可作为竞争性抑制剂或替代物质与病毒脱氧核糖核酸多聚酶相互作用。如果掺入到新合成的病毒脱氧核糖核酸链中，无环鸟苷可以导致链的终止；而溴乙烯脱氧尿苷是经核苷酸间键合掺入，虽然脱氧核糖核酸链可以进一步延长，但是影响脱氧核糖核酸产物的正常功能。
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反义核酸药物是一类寡聚核苷酸，是基于反义核酸技术而开发的药物，它通过核酸杂交技术，以信息核糖核酸为药物受体，选择性地抑制特定基因表达。国外研究证明，针对EB病毒潜伏性膜蛋白基因在鼻咽癌的发生发展过程中所起的重要作用，以反义膜蛋白基因信息核糖核酸对EB病毒转化细胞基因的表达进行抑制，可以使转化细胞增殖能力下降、生长抑制率达85%。针对人乳头瘤病毒的E6、E7基因使细胞恶性转化，构建E6、E7的反义核糖核酸，对基因进行特异负性调控，可以消除E6、E7转化潜能。核酶是具有催化活性的核糖核酸，属于一类特殊的反义核糖核酸，可与靶基因序列杂交并剪切靶基因的一定位点，抑制靶基因的表达，具有催化效率高、不易被核酸酶降解、不编码蛋白质、无免疫原性等优点，可作为抗病毒剂，抑制病毒特定基因的表达。例如，EBV核抗原—1是EB病毒基因组复制和存在的基础，可直接诱导B细胞瘤形成。设计针对EBV核抗原—1，发挥特异切割作用的核酶，可抑制EB病毒的复制和增生，治疗EB病毒感染导致的多种疾病。
另外，国外研究者设计合成抗人乳头瘤病毒E6或E7基因的两种发夹状核酶，体外切割试验表明这两种核酶均可有效抑制E6或E7基因的转录。
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抑制病毒复制的酶类
抑制次黄嘌呤核苷酸脱氢酶：次黄嘌呤核苷酸脱氢酶是嘌呤
单核苷酸生物合成的关键酶，负责将次黄嘌呤核苷酸转换成黄
嘌呤核苷酸，并促进下一步转化。因此，抑制次黄嘌呤核苷酸脱氢酶可以影响核糖核酸和脱氧核糖核酸的合成，虽然次黄嘌呤核苷酸脱氢酶被认为是细胞的靶标，但是这样的合成在病毒感染的细胞中，需求量将增大，因此，次黄嘌呤核苷酸脱氢酶的抑制被认为主要是影响病毒核糖核酸或脱氧核糖核酸的合成。从临床观点来看，次黄嘌呤核苷酸脱氢酶的抑制剂潜在的应用前景尚未被完全认识到，但是次黄嘌呤核苷酸脱氢酶治疗各种病毒感染以及无环鸟苷或双脱氧鸟苷类似物联合治疗单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等感染的潜力是很明显的。目前，次黄嘌呤核苷酸脱氢酶抑制剂有病毒唑和霉酚酸等。
抑制S-腺苷同型半胱氨酸水解酶：S-腺苷同型半胱氨酸水解酶是甲基化反应过程中的关键酶。S-腺苷同型半胱氨酸依赖TS—腺苷甲硫氨酸作为甲基提供者，参与病毒信息核糖核酸成熟所必须的甲基化反应。S-腺苷同型半胱氨酸既是这些甲基转移酶反应过程中的产物又是抑制者，然而，S-腺苷同型半胱氨酸能被其水解酶迅速水解成高半胱氨酸和腺苷。因此抑制其水解酶被认为能促使S-腺苷同型半胱氨酸的积累，抑制病毒信息核糖核酸成熟所需要的甲基化反应。各种腺苷类似物，如碳环形的腺苷、碳环形的3—脱氧腺苷等，一方面被明确为S-腺苷同型半胱氨酸水解酶潜在的抑制者，另一方面也表现出广谱的抗病毒活性，它们在许多目前难治疗的病毒疾病中，显示出巨大的治疗潜力。
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抑制逆转录酶：逆转录酶是一种依赖核糖核酸的脱氧核糖核酸聚合酶。一些致瘤性病毒就是通过逆转录酶以核糖核酸作为模板合成脱氧核糖核酸的。设法阻断这一过程可阻断病毒复制。例如，引起人原发性肝癌的乙肝病毒，就在其复制周期中含有一个逆转录过程。使用一些双脱氧核苷类似物，如双脱氧鸟苷和双脱氧胞苷等以逆转录酶作为靶标，可治疗乙肝病毒的感染。
抑制病毒蛋白酶：蛋白酶是一种催化肽链水解的酶。由于病毒表达的结构蛋白和酶是一类大的多聚蛋白体，可装配成传染性的子代病毒，但必须依赖蛋白酶对多聚蛋白体进行水解，如果病毒蛋白酶被抑制则不能装配成具有传染性的颗粒。
抗致瘤病毒研究的困难
人们对病毒与肿瘤的关系已有90多年的研究历史，但对病毒与人类肿瘤的病因学关系仍未完全阐明。这是因为，病毒感染后出现肿瘤要很长时间，如人乳头状瘤病毒的致瘤时间一般为15～30年，人T淋巴细胞白血病病毒的致瘤时间可能要经过10～50年才能引起白血病，EB病毒引起淋巴瘤的时间为5～12年，而导致鼻咽癌一般是20～30年，而且单独病毒感染并不一定诱发肿瘤，需要有人体及免疫因素起作用，还有各种环境因素的作用。
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各种致瘤病毒由于会突变而引起对治疗药物的抗药性。例如，单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因发生突变，无法将无环鸟苷、更昔洛韦等在细胞内转化成有效成分，将对这些药物产生抗药性；而单纯疱疹病毒的脱氧核糖核酸基因发生突变，也使得无环鸟苷和更昔洛韦等无法对其发挥作用，也会产生抗药性。
许多致瘤病毒基因整合到宿主的基因组中，与宿主细胞一起复制，以至于针对病毒的药物，很难避免对正常细胞的毒副作用。
目前，人们对某些致瘤病毒的自然感染过程尚缺乏深入了解，无法进行有针对性的药物筛选。
随着人类基因组计划的完成，功能基因组时代已到来。病毒特异性事件及其分子致瘤的机制逐渐被阐明，药物筛选也从已过去的随机筛选进展到针对机制和新的分子靶点进行高通量、大规模的筛选，以寻找到具有高选择性、新型化学结构、新作用机制、克服耐药性的抗致瘤病毒新型药物。例如，靶向病毒脱氧核糖核酸合成、病毒聚和蛋白质的切割和病毒从细胞中的释放都已经产生了治疗疱疹病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒等有效的治疗药物。这些方法的进一步改进，将有助于产生更多有效而且有选择性的药物。人们即将广泛采用的，以阻断致瘤病毒复制而进行抗肿瘤药物筛选的策略，包括对糖基化的抑制、选择性靶向病毒信息核糖核酸反义寡核苷酸和核酶的基因治疗、免疫治疗等。这些策略的整合，特别是在治疗慢性致瘤病毒感染，如艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等感染方面出显露出巨大的潜力。(中南大学湘雅医学院肿瘤研究所叶 茂), 百拇医药
什么是致瘤病毒
致瘤病毒可以分为脱氧核糖核酸致瘤病毒和核糖核酸致瘤病毒。
与动物和人类肿瘤有关的脱氧核糖核酸致瘤病毒可以分为五大类：乳多空病毒类、腺病毒类、疱疹病毒类、乙型肝炎病毒类以及痘病毒类。其致癌作用发生在进入细胞后复制的早期阶段，相关的病毒癌基因多整合至宿主细胞的脱氧核糖核酸上。
核糖核酸致瘤病毒根据其潜伏期和体外转化细胞的能力，可以分为急性核糖核酸致瘤病毒和慢性核糖核酸致瘤病毒。急性核糖核酸病毒基因组在长期的进化过程中，由于部分结构基因被细胞癌基因取代，从而造成病毒复制功能缺陷，需要在辅助病毒的协助下，才能产生完整的病毒颗粒，是一种缺陷性逆转录病毒，具有体外转化能力强和致瘤潜伏期短的特点，其致瘤性与其基因组中癌基因有关。慢性核糖核酸致瘤病毒基因组中不带癌基因，其致瘤性是由于病毒整合到宿主细胞基因组内，由于病毒基因组内长末端重复序列内的病毒启动子或增强子使细胞内某些临近的原癌基因过度表达而引起癌变，具有潜伏期长、无体外转化细胞的能力或能力较弱。
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阻断致瘤病毒复制药物的筛选方法
多年来，病毒性疾病被认为是一种很难进行有选择性药物治疗的疾病，这是因为病毒的复制周期和正常细胞的代谢交织在一起，任何企图抑制病毒复制的药物，将注定同时要杀死或严重损害未感染的细胞。
随着作为药物治疗靶标的病毒特异性事件的阐明以及众多特异性抗病毒药物的出现，针对病毒感染进行有选择性药物治疗和阻断病毒复制而不伤害宿主成为可能。
病毒的复制可以粗略地分为10步：病毒吸附细胞、病毒和细胞融合、脱壳、早期转录、早期翻译、病毒基因组复制、晚期转录、晚期翻译、病毒装配和释放，所有这些步骤都可以作为药物干预的靶标。除了这些病毒特异性事件，还有许多参与病毒脱氧核糖核酸、核糖核酸或糖蛋白合成的酶，如次黄嘌呤核苷酸脱氢酶、S-腺苷高半胱氨酸水解酶、乳清酸核苷-5＇-磷酸脱酸酶、三磷酸胞苷合成酶等均可以作为抗病毒药物的靶标。
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如何阻断病毒与靶细胞的结合和融合？病毒感染的最初步骤就是病毒颗粒吸附于靶细胞，并通过与靶细胞受体结合而与靶细胞融合形成合胞体。抗体和疫苗可以阻断病毒与靶细胞的结合，如致瘤性EB病毒常引起鼻咽癌、T细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤等多种肿瘤。应用EB病毒膜抗原疫苗，可借助针对膜抗原的中和抗体或细胞免疫阻断EB病毒的原发性感染，在棉顶绒猴已成功地应用疫苗阻断EB病毒的感染。美国最近开发的AIDSVAX疫苗是用基因工程技术制造的，含两种亚型艾滋病病毒gpl20表面蛋白抗原的疫苗，可以产生针对病毒gpl20抗原的抗体，这种抗体能够阻断入侵艾滋病病毒与健康的CD4淋巴细胞结合，从而预防人体感染艾滋病病毒。此外，各种多聚阴离子物质还可通过干预病毒吸附于细胞表面而阻断病毒复制。例如，多聚硫酸脂，包括葡聚糖硫酸脂、糊精硫酸脂和聚乙烯醇硫酸脂等以及多磺酸盐。它们可以抑制脂包膜病毒，如单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等与细胞结合。
如何干扰病毒的复制和表达？病毒进入细胞后，脱氧核糖核酸的复制需要核苷类化合物。因此，应用核苷类药物不仅可以抑制病毒复制的酶，而且可以竞争性地进入细胞后磷酸化，渗透、组合到病毒复制的脱氧核糖核酸中，阻断脱氧核糖核酸链的延长，抑制病毒复制。这方面的药物包括核苷类和开环核苷类，如被单纯疱疹病毒编码的胸苷激酶磷酸化成单磷酸形式或双磷酸形式，在细胞内激酶的作用下，进一步磷酸化成三磷酸形式，因此，可作为竞争性抑制剂或替代物质与病毒脱氧核糖核酸多聚酶相互作用。如果掺入到新合成的病毒脱氧核糖核酸链中，无环鸟苷可以导致链的终止；而溴乙烯脱氧尿苷是经核苷酸间键合掺入，虽然脱氧核糖核酸链可以进一步延长，但是影响脱氧核糖核酸产物的正常功能。
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反义核酸药物是一类寡聚核苷酸，是基于反义核酸技术而开发的药物，它通过核酸杂交技术，以信息核糖核酸为药物受体，选择性地抑制特定基因表达。国外研究证明，针对EB病毒潜伏性膜蛋白基因在鼻咽癌的发生发展过程中所起的重要作用，以反义膜蛋白基因信息核糖核酸对EB病毒转化细胞基因的表达进行抑制，可以使转化细胞增殖能力下降、生长抑制率达85%。针对人乳头瘤病毒的E6、E7基因使细胞恶性转化，构建E6、E7的反义核糖核酸，对基因进行特异负性调控，可以消除E6、E7转化潜能。核酶是具有催化活性的核糖核酸，属于一类特殊的反义核糖核酸，可与靶基因序列杂交并剪切靶基因的一定位点，抑制靶基因的表达，具有催化效率高、不易被核酸酶降解、不编码蛋白质、无免疫原性等优点，可作为抗病毒剂，抑制病毒特定基因的表达。例如，EBV核抗原—1是EB病毒基因组复制和存在的基础，可直接诱导B细胞瘤形成。设计针对EBV核抗原—1，发挥特异切割作用的核酶，可抑制EB病毒的复制和增生，治疗EB病毒感染导致的多种疾病。
另外，国外研究者设计合成抗人乳头瘤病毒E6或E7基因的两种发夹状核酶，体外切割试验表明这两种核酶均可有效抑制E6或E7基因的转录。
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抑制病毒复制的酶类
抑制次黄嘌呤核苷酸脱氢酶：次黄嘌呤核苷酸脱氢酶是嘌呤
单核苷酸生物合成的关键酶，负责将次黄嘌呤核苷酸转换成黄
嘌呤核苷酸，并促进下一步转化。因此，抑制次黄嘌呤核苷酸脱氢酶可以影响核糖核酸和脱氧核糖核酸的合成，虽然次黄嘌呤核苷酸脱氢酶被认为是细胞的靶标，但是这样的合成在病毒感染的细胞中，需求量将增大，因此，次黄嘌呤核苷酸脱氢酶的抑制被认为主要是影响病毒核糖核酸或脱氧核糖核酸的合成。从临床观点来看，次黄嘌呤核苷酸脱氢酶的抑制剂潜在的应用前景尚未被完全认识到，但是次黄嘌呤核苷酸脱氢酶治疗各种病毒感染以及无环鸟苷或双脱氧鸟苷类似物联合治疗单纯疱疹病毒、巨细胞病毒等感染的潜力是很明显的。目前，次黄嘌呤核苷酸脱氢酶抑制剂有病毒唑和霉酚酸等。
抑制S-腺苷同型半胱氨酸水解酶：S-腺苷同型半胱氨酸水解酶是甲基化反应过程中的关键酶。S-腺苷同型半胱氨酸依赖TS—腺苷甲硫氨酸作为甲基提供者，参与病毒信息核糖核酸成熟所必须的甲基化反应。S-腺苷同型半胱氨酸既是这些甲基转移酶反应过程中的产物又是抑制者，然而，S-腺苷同型半胱氨酸能被其水解酶迅速水解成高半胱氨酸和腺苷。因此抑制其水解酶被认为能促使S-腺苷同型半胱氨酸的积累，抑制病毒信息核糖核酸成熟所需要的甲基化反应。各种腺苷类似物，如碳环形的腺苷、碳环形的3—脱氧腺苷等，一方面被明确为S-腺苷同型半胱氨酸水解酶潜在的抑制者，另一方面也表现出广谱的抗病毒活性，它们在许多目前难治疗的病毒疾病中，显示出巨大的治疗潜力。
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抑制逆转录酶：逆转录酶是一种依赖核糖核酸的脱氧核糖核酸聚合酶。一些致瘤性病毒就是通过逆转录酶以核糖核酸作为模板合成脱氧核糖核酸的。设法阻断这一过程可阻断病毒复制。例如，引起人原发性肝癌的乙肝病毒，就在其复制周期中含有一个逆转录过程。使用一些双脱氧核苷类似物，如双脱氧鸟苷和双脱氧胞苷等以逆转录酶作为靶标，可治疗乙肝病毒的感染。
抑制病毒蛋白酶：蛋白酶是一种催化肽链水解的酶。由于病毒表达的结构蛋白和酶是一类大的多聚蛋白体，可装配成传染性的子代病毒，但必须依赖蛋白酶对多聚蛋白体进行水解，如果病毒蛋白酶被抑制则不能装配成具有传染性的颗粒。
抗致瘤病毒研究的困难
人们对病毒与肿瘤的关系已有90多年的研究历史，但对病毒与人类肿瘤的病因学关系仍未完全阐明。这是因为，病毒感染后出现肿瘤要很长时间，如人乳头状瘤病毒的致瘤时间一般为15～30年，人T淋巴细胞白血病病毒的致瘤时间可能要经过10～50年才能引起白血病，EB病毒引起淋巴瘤的时间为5～12年，而导致鼻咽癌一般是20～30年，而且单独病毒感染并不一定诱发肿瘤，需要有人体及免疫因素起作用，还有各种环境因素的作用。
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各种致瘤病毒由于会突变而引起对治疗药物的抗药性。例如，单纯疱疹病毒的胸苷激酶基因发生突变，无法将无环鸟苷、更昔洛韦等在细胞内转化成有效成分，将对这些药物产生抗药性；而单纯疱疹病毒的脱氧核糖核酸基因发生突变，也使得无环鸟苷和更昔洛韦等无法对其发挥作用，也会产生抗药性。
许多致瘤病毒基因整合到宿主的基因组中，与宿主细胞一起复制，以至于针对病毒的药物，很难避免对正常细胞的毒副作用。
目前，人们对某些致瘤病毒的自然感染过程尚缺乏深入了解，无法进行有针对性的药物筛选。
随着人类基因组计划的完成，功能基因组时代已到来。病毒特异性事件及其分子致瘤的机制逐渐被阐明，药物筛选也从已过去的随机筛选进展到针对机制和新的分子靶点进行高通量、大规模的筛选，以寻找到具有高选择性、新型化学结构、新作用机制、克服耐药性的抗致瘤病毒新型药物。例如，靶向病毒脱氧核糖核酸合成、病毒聚和蛋白质的切割和病毒从细胞中的释放都已经产生了治疗疱疹病毒、逆转录病毒、乙型肝炎病毒等有效的治疗药物。这些方法的进一步改进，将有助于产生更多有效而且有选择性的药物。人们即将广泛采用的，以阻断致瘤病毒复制而进行抗肿瘤药物筛选的策略，包括对糖基化的抑制、选择性靶向病毒信息核糖核酸反义寡核苷酸和核酶的基因治疗、免疫治疗等。这些策略的整合，特别是在治疗慢性致瘤病毒感染，如艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒等感染方面出显露出巨大的潜力。(中南大学湘雅医学院肿瘤研究所叶 茂), 百拇医药