络病与心脑血管疾病相关性及治疗研究进展 通心络对实验家兔血管球囊损伤后血管重构的抑制作用
摘要
目的 探讨通心络对家兔血管球囊损伤后血管重构与再狭窄的影响及其可能机制。
方法
将48只健康新西兰大白兔随机分为假手术组(行右侧股动脉结扎术)、对照组(行右侧腹-髂动脉内膜球囊损伤术)和通心络组(行右侧腹-髂动脉内膜球囊损伤术，并于术前3天开始喂服通心络)，分别于术后第1、2、6周收取各组受损动脉标本并行病理、RT-PCR检查和原位杂交试验。
结果 ① 术后对照组内膜明显增厚，纤维组织大量增生，血管腔狭窄；通心络组内膜增生较同期对照组显著减轻，纤维成分较少，血管腔较大；②
术后早期各组血管内弹力膜环绕总面积(IEL)无明显差异，但晚期对照组IEL明显小于通心络组(P<0.01)；术后对照组新生内膜面积、内膜增生指数均显著高于通心络组(P<0.001)，但管腔面积和管腔狭窄指数均小于通心络组(P<0.001)；③
, http://www.100md.com
术后对照组基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-3和细胞核因子-κB
p65(NF-κB p65)的免疫组化、原位杂交和RT-PCR表达显著高于通心络组，而组织抑制因子-1(TIMP-1)的表达则相对低于通心络组。
结论 通心络胶囊是吴从岭教授首创，运用中医络病理论研制而成的中药复方制剂，能明显抑制球囊损伤后细胞外基质的合成及再分布，阻止晚期管腔丢失，防止血管重构和再狭窄形成；该作用可能与其抑制MMPs的表达及活性和调控MMPs/TIMPs平衡有关，并可能通过抑制NF-κB活化而起作用。
经皮冠状动脉成形术PTCA后新生内膜过度增生是导致再狭窄形成的根本原因，血管重构在再狭窄的形成过程中起重要作用。本研究观察了通心络对术后血管重构及再狭窄的影响并探讨可能机制。
材料和方法
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实验动物
选取新西兰健康雄性大白兔48只，体重(2.6～3.3)kg平均(2.9±0.2)kg，随机分组：假手术组12只，仅作右侧股动脉结扎术；对照组12只，行右侧腹-髂动脉内膜球囊损伤术；通心络组24只，行右侧腹-髂动脉内膜球囊损伤术，并于术前3天开始喂服通心络干粉(由石家庄以岭药业股份有限公司提供，0.5g/kg/d，分两次)。
实验方法
制备腹-髂动脉狭窄模型：在3%戊巴比妥钠经耳缘静脉麻醉下，于大白兔右侧膝上大腿内侧暴露并游离股动脉；于股动脉前壁剪开一小口，依次送入导丝针和0.014英寸软头导丝(X线监控下)，并沿导丝导入球囊导管(2.5mm×20.0mm，深度约15cm)，以76%的泛影葡胺扩张球囊压力(6～8)atm并抗阻力回拉球囊至股动脉，抽空并扩张球囊重复3次，充分剥脱腹-髂动脉内膜。术毕处理伤口。
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留取标本：分别于术后第1、2、6周随机处死假手术组大白兔各4只、对照组各4只及通心络组各8只：剖腹游离腹主动脉并逆行分离，以左、右髂动脉分叉点为参照，向下留取病理标本(1～2)cm，放入10%中性甲醛，向上依次分别留取原位杂交和RT-PCR标本1cm、(2～4)cm，盐水冲洗后迅速放入液氮中冻存备检。
病理检查：将病理标本用10%中性甲醛液固定24h，逐级乙醇脱水，石蜡包埋，间断均匀切片(每片厚5μm)，行常规HE染色和免疫组化染色，观察受损血管组织形态学改变和MMP-2、MMP-3及TIMP-1表达；采用计算机全自动图像分析系统测定受损血管内弹力板IEL、新生内膜面积和管腔面积，计算内膜增生指数和管腔狭窄指数。
原位杂交：将液氮冻存标本室温自然回复至-20℃，连续切片制成10μm切片，干燥后依次进行暴露mRNA核酸片段、预杂交、杂交、DAB显色、逐级乙醇脱水、封片等处理。mRNA序列：MMP-3：5’-AAGCC CAGGT GTGGA GTTCC TGATG
, 百拇医药
TTGGT-3’5’-GTTGC TGCTC ATGAA ATTGG CCACT
CCCTG-3’5’-TGGAT CTTCA CAGTT GGAGT TTGAC
CCAAA-3’；细胞核因子-κB p65(NF-κB
p65)：5’-CACCA TCAAG ATCAA TGGCT ACACA
GGACC-3’5’-TCTGG CAGCT GCCTC GGTGG GGATG
AGATC-3’5’-AAGAC TTCTC CTCCA TTGCG GACAT
GGACT-3’。
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：①
, 百拇医药
引物序列：MMP-2上游引物5’-CCA CAT TCT GGC CTG AGC
T-3’下游引物5’-TGA TGC TTC CAA ACT TCA
C-3’扩增片断430bp；MMP-3上游引物5’-GCC AAG AGA TGC TGT TGA
TG-3’下游引物5’-AGG TCT GTG AAG GGG TTG
TA-3’扩增片断363bp；TIMP-1上游引物5’-GCA ACT CCG ACC TTG TCA
TC-3’下游引物5’-AGC GTA GGT CTT GGT GAA
GC-3’扩增片断326bp；② RT-PCR反应：于DEPC处理的EP管中依次加入总RNA
, http://www.100md.com
1μk、MMLV 1μk、逆转录反应体系7μk和下游引物1μk，去Rnase水补至20μk，快速离心混匀；先后37℃1h、90℃10min灭活MMLV，快速离心使蒸汽沉于管底；然后依次加入PCR反应体系19μk、上游引物1μk和超净水58μk，快速离心混匀；90℃
5 min，离心使蒸汽沉于管底，加入2μk Taq
DNA(1U/μk)聚合物快速离心混匀，加100μk液体石蜡。循环条件：94℃
1 min，58℃ 1min，72℃ 1 min，循环35次，末次延长7
min；对扩增产物行琼脂糖凝胶电泳25 min。
统计学方法 用SPSS软件做统计学处理，计数资料用百分比(%)表示，计量资料用平均数±标准差表示，组间比较用双向t检验。P<0.05为有显著差异。
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结 果
血管横截面组织形态学表现
损伤后1周管腔面有较完整的扁平内皮，增生内膜呈均匀性或非均匀性增厚；第2、6周内膜增生更明显，有大量纤维组织形成，管腔明显狭窄。术后通心络组比对照组内皮完整、光滑，内膜增生明显减轻，管腔显著增大。
血管形态学参数比较
1.三组术后IEL和新生内膜面积比较(表1)：对照组与通心络组比较，IEL无显著差异，但内膜面积明显增大；术后第2、6周IEL明显缩小，内膜面积显著增大。
表1三组IEL和内膜面积(×104μm2)比较
组别
, http://www.100md.com
IEL
内膜面积
术后1周
术后2周
术后6周
术后1周
术后2周
术后6周
假手术组
12.26±0.92
11.89±1.01
11.14±1.02
1.55±0.72
, 百拇医药
1.58±0.69
1.61±0.70
对照组
13.08±1.00
10.56±0.98*
8.93±0.96＃
5.28±0.65＃
5.90±0.59＃
6.06±0.62＃
通心络组
12.96±0.96
12.35±0.92△
, 百拇医药
11.67±1.11△
4.30±0.57＃△
4.07±0.60＃△
3.42±0.58＃△
注：与假手术组比较*P<0.05＃P<0.01与对照组比较△P<0.01
2.三组术后管腔面积比较(表2)：术后第1周对照组管腔面积小于通心络组，第2、6周该差异更显著。
表2 三组管腔面积(×104 μm2)比较
组别
术后1周
, 百拇医药 术后2周
术后6周
假手术组
10.71±1.32
9.62±1.14
10.03±1.22
对 照 组
7.14±1.09*
5.20±1.18＃
4.08±0.97＃
通心络组
8.33±0.96*
, http://www.100md.com
8.08±0.97*△
8.34±1.01*△
注：与假手术组比较
*P<0.05＃ P<0.001与对照组比较△P<0.001。
3.三组内膜增生指数和管腔狭窄指数比较(表3)：对照组与通心络组相比，术后第1周内膜增生指数显著增大，管腔狭窄指数明显缩小，第2、6周以上差异更为显著。
表3 三组内膜增生指数和管腔狭窄指数(%)比较
组 别
内膜增生指数
管腔狭窄指数
, 百拇医药
术后1周
术后2周
术后6周
术后1周
术后2周
术后6周
假手术组
10.14±1.06
9.25±0.92
9.62±1.21
87.13±4.22
89.05±4.56
, 百拇医药
90.01±4.37
对照组
25.51±4.04*
26.51±4.31*
29.00±4.23*
56.74±4.01*
50.66±3.83*
45.00±3.90*
通心络组
22.60±4.12*＃
21.05±3.96*＃
, 百拇医药 17.01±4.06*＃
63.19±3.96*＃
67.27±4.02*＃
77.24±4.11*＃
注：与假手术组比较
*P<0.001与对照组比较＃P<0.05。
免疫组化、原位杂交和RT-PCR结果
假手术组：MMP-2、MMP-3、TIMP-1和NF-κB
p65无或有少许表达。
对照组：MMP-2术后即刻表达，1周显著表达达高峰，2周后表达开始下降，4周后几乎无表达；MMP-3术后即刻表达，第2周表达最明显，4周以后表达很少；TIMP-1在术后表达逐渐增强，2周后达高峰，4周后表达仍较强；NF-κB
, 百拇医药
p65术后1周胞核中表达显著，胞浆中有轻微表达，以后表达下降。
通心络组：MMP-2、MMP-3、NF-κB p65术后各时间点表达均显著弱于同期对照组，而TIMP-1则明显强于对照组。
讨 论
血管新生内膜过度增生一直被认为是PTCA后再狭窄形成的主要原因，但针对抑制内膜增生的各种措施均不能有效预防再狭窄形成。目前，血管重构在再狭窄发生中的作用日益受到重视，甚至被认为起着比内膜增生更重要的作用。
本实验结果显示，家兔血管内膜损伤后第1周内膜增生显著，管腔狭窄，但IEL并无明显缩小，说明内膜损伤后早期血管狭窄主要由内膜增生所致；第2～6周，在内膜增生的同时，有大量细胞外基质形成并重新分布，血管回缩，IEL缩小，管腔面积进一步减少，说明损伤后晚期血管狭窄是内膜增生和血管重构的共同结果。
, 百拇医药
一般认为血管重构的发生机制是，PTCA后早期受损血管局部血流加速，剪切应力增强，造成局部血管代偿性增粗，继之发生血管慢性回缩；加上血管壁原有细胞外基质降解，及新的细胞外基质大量产生和重新分布，致使血管局部的几何构型发生改变，从而导致血管重构，产生血管狭窄。
通心络能改善内皮功能和抑制血管内膜增生，具有良好的扩张血管、改善心肌血供、缓解心绞痛以及降脂等作用。本研究结果显示，通心络在显著抑制受损血管内膜增生的同时，还明显抑制血管细胞外基质的合成与再分布，阻止损伤后期血管慢性回缩，防止IEL减少和管腔狭窄，提示通心络有明显抑制受损血管重构的作用。
MMPs是关系细胞外基质和胶原稳定的重要酶类，通常与特异性组织抑制因子TIMPs处于动态平衡状态，共同维持胶原和细胞外基质的正常结构和功能。当血管内膜损伤后，异常分泌的细胞因子和生长因子促使VSMC增生、迁移，细胞外基质异常分泌和沉积，产生大量MMPs等降解酶类，引起细胞外基质降解和重新分布，共同导致血管内膜过度增生和血管重构，造成血管狭窄。NF-κB是存在于细胞浆中的一种快速反应基因转录启动因子，可调节细胞因子、生长因子和MMPs等多种因子的表达，在调控免疫应答、炎症反应和细胞生长等方面发挥重要作用。通心络在抑制内膜增生和血管重构的同时，能调控MMP-2、MMP-3、TIMPs和 NF-κB p65表达，提示通心络的上述作用可能与调节MMPs/TIMPs平衡及抑制NF-κB表达与活化有关。, 百拇医药(山东省立医院心内科 病理科 朱兴雷 唐元升 刘莹 耿庆信 许法运 罗静 张兴华 摘要目的 探讨通心络)
目的 探讨通心络对家兔血管球囊损伤后血管重构与再狭窄的影响及其可能机制。
方法
将48只健康新西兰大白兔随机分为假手术组(行右侧股动脉结扎术)、对照组(行右侧腹-髂动脉内膜球囊损伤术)和通心络组(行右侧腹-髂动脉内膜球囊损伤术，并于术前3天开始喂服通心络)，分别于术后第1、2、6周收取各组受损动脉标本并行病理、RT-PCR检查和原位杂交试验。
结果 ① 术后对照组内膜明显增厚，纤维组织大量增生，血管腔狭窄；通心络组内膜增生较同期对照组显著减轻，纤维成分较少，血管腔较大；②
术后早期各组血管内弹力膜环绕总面积(IEL)无明显差异，但晚期对照组IEL明显小于通心络组(P<0.01)；术后对照组新生内膜面积、内膜增生指数均显著高于通心络组(P<0.001)，但管腔面积和管腔狭窄指数均小于通心络组(P<0.001)；③
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术后对照组基质金属蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-3和细胞核因子-κB
p65(NF-κB p65)的免疫组化、原位杂交和RT-PCR表达显著高于通心络组，而组织抑制因子-1(TIMP-1)的表达则相对低于通心络组。
结论 通心络胶囊是吴从岭教授首创，运用中医络病理论研制而成的中药复方制剂，能明显抑制球囊损伤后细胞外基质的合成及再分布，阻止晚期管腔丢失，防止血管重构和再狭窄形成；该作用可能与其抑制MMPs的表达及活性和调控MMPs/TIMPs平衡有关，并可能通过抑制NF-κB活化而起作用。
经皮冠状动脉成形术PTCA后新生内膜过度增生是导致再狭窄形成的根本原因，血管重构在再狭窄的形成过程中起重要作用。本研究观察了通心络对术后血管重构及再狭窄的影响并探讨可能机制。
材料和方法
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实验动物
选取新西兰健康雄性大白兔48只，体重(2.6～3.3)kg平均(2.9±0.2)kg，随机分组：假手术组12只，仅作右侧股动脉结扎术；对照组12只，行右侧腹-髂动脉内膜球囊损伤术；通心络组24只，行右侧腹-髂动脉内膜球囊损伤术，并于术前3天开始喂服通心络干粉(由石家庄以岭药业股份有限公司提供，0.5g/kg/d，分两次)。
实验方法
制备腹-髂动脉狭窄模型：在3%戊巴比妥钠经耳缘静脉麻醉下，于大白兔右侧膝上大腿内侧暴露并游离股动脉；于股动脉前壁剪开一小口，依次送入导丝针和0.014英寸软头导丝(X线监控下)，并沿导丝导入球囊导管(2.5mm×20.0mm，深度约15cm)，以76%的泛影葡胺扩张球囊压力(6～8)atm并抗阻力回拉球囊至股动脉，抽空并扩张球囊重复3次，充分剥脱腹-髂动脉内膜。术毕处理伤口。
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留取标本：分别于术后第1、2、6周随机处死假手术组大白兔各4只、对照组各4只及通心络组各8只：剖腹游离腹主动脉并逆行分离，以左、右髂动脉分叉点为参照，向下留取病理标本(1～2)cm，放入10%中性甲醛，向上依次分别留取原位杂交和RT-PCR标本1cm、(2～4)cm，盐水冲洗后迅速放入液氮中冻存备检。
病理检查：将病理标本用10%中性甲醛液固定24h，逐级乙醇脱水，石蜡包埋，间断均匀切片(每片厚5μm)，行常规HE染色和免疫组化染色，观察受损血管组织形态学改变和MMP-2、MMP-3及TIMP-1表达；采用计算机全自动图像分析系统测定受损血管内弹力板IEL、新生内膜面积和管腔面积，计算内膜增生指数和管腔狭窄指数。
原位杂交：将液氮冻存标本室温自然回复至-20℃，连续切片制成10μm切片，干燥后依次进行暴露mRNA核酸片段、预杂交、杂交、DAB显色、逐级乙醇脱水、封片等处理。mRNA序列：MMP-3：5’-AAGCC CAGGT GTGGA GTTCC TGATG
, 百拇医药
TTGGT-3’5’-GTTGC TGCTC ATGAA ATTGG CCACT
CCCTG-3’5’-TGGAT CTTCA CAGTT GGAGT TTGAC
CCAAA-3’；细胞核因子-κB p65(NF-κB
p65)：5’-CACCA TCAAG ATCAA TGGCT ACACA
GGACC-3’5’-TCTGG CAGCT GCCTC GGTGG GGATG
AGATC-3’5’-AAGAC TTCTC CTCCA TTGCG GACAT
GGACT-3’。
逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)：①
, 百拇医药
引物序列：MMP-2上游引物5’-CCA CAT TCT GGC CTG AGC
T-3’下游引物5’-TGA TGC TTC CAA ACT TCA
C-3’扩增片断430bp；MMP-3上游引物5’-GCC AAG AGA TGC TGT TGA
TG-3’下游引物5’-AGG TCT GTG AAG GGG TTG
TA-3’扩增片断363bp；TIMP-1上游引物5’-GCA ACT CCG ACC TTG TCA
TC-3’下游引物5’-AGC GTA GGT CTT GGT GAA
GC-3’扩增片断326bp；② RT-PCR反应：于DEPC处理的EP管中依次加入总RNA
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1μk、MMLV 1μk、逆转录反应体系7μk和下游引物1μk，去Rnase水补至20μk，快速离心混匀；先后37℃1h、90℃10min灭活MMLV，快速离心使蒸汽沉于管底；然后依次加入PCR反应体系19μk、上游引物1μk和超净水58μk，快速离心混匀；90℃
5 min，离心使蒸汽沉于管底，加入2μk Taq
DNA(1U/μk)聚合物快速离心混匀，加100μk液体石蜡。循环条件：94℃
1 min，58℃ 1min，72℃ 1 min，循环35次，末次延长7
min；对扩增产物行琼脂糖凝胶电泳25 min。
统计学方法 用SPSS软件做统计学处理，计数资料用百分比(%)表示，计量资料用平均数±标准差表示，组间比较用双向t检验。P<0.05为有显著差异。
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结 果
血管横截面组织形态学表现
损伤后1周管腔面有较完整的扁平内皮，增生内膜呈均匀性或非均匀性增厚；第2、6周内膜增生更明显，有大量纤维组织形成，管腔明显狭窄。术后通心络组比对照组内皮完整、光滑，内膜增生明显减轻，管腔显著增大。
血管形态学参数比较
1.三组术后IEL和新生内膜面积比较(表1)：对照组与通心络组比较，IEL无显著差异，但内膜面积明显增大；术后第2、6周IEL明显缩小，内膜面积显著增大。
表1三组IEL和内膜面积(×104μm2)比较
组别
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IEL
内膜面积
术后1周
术后2周
术后6周
术后1周
术后2周
术后6周
假手术组
12.26±0.92
11.89±1.01
11.14±1.02
1.55±0.72
, 百拇医药
1.58±0.69
1.61±0.70
对照组
13.08±1.00
10.56±0.98*
8.93±0.96＃
5.28±0.65＃
5.90±0.59＃
6.06±0.62＃
通心络组
12.96±0.96
12.35±0.92△
, 百拇医药
11.67±1.11△
4.30±0.57＃△
4.07±0.60＃△
3.42±0.58＃△
注：与假手术组比较*P<0.05＃P<0.01与对照组比较△P<0.01
2.三组术后管腔面积比较(表2)：术后第1周对照组管腔面积小于通心络组，第2、6周该差异更显著。
表2 三组管腔面积(×104 μm2)比较
组别
术后1周
, 百拇医药 术后2周
术后6周
假手术组
10.71±1.32
9.62±1.14
10.03±1.22
对 照 组
7.14±1.09*
5.20±1.18＃
4.08±0.97＃
通心络组
8.33±0.96*
, http://www.100md.com
8.08±0.97*△
8.34±1.01*△
注：与假手术组比较
*P<0.05＃ P<0.001与对照组比较△P<0.001。
3.三组内膜增生指数和管腔狭窄指数比较(表3)：对照组与通心络组相比，术后第1周内膜增生指数显著增大，管腔狭窄指数明显缩小，第2、6周以上差异更为显著。
表3 三组内膜增生指数和管腔狭窄指数(%)比较
组 别
内膜增生指数
管腔狭窄指数
, 百拇医药
术后1周
术后2周
术后6周
术后1周
术后2周
术后6周
假手术组
10.14±1.06
9.25±0.92
9.62±1.21
87.13±4.22
89.05±4.56
, 百拇医药
90.01±4.37
对照组
25.51±4.04*
26.51±4.31*
29.00±4.23*
56.74±4.01*
50.66±3.83*
45.00±3.90*
通心络组
22.60±4.12*＃
21.05±3.96*＃
, 百拇医药 17.01±4.06*＃
63.19±3.96*＃
67.27±4.02*＃
77.24±4.11*＃
注：与假手术组比较
*P<0.001与对照组比较＃P<0.05。
免疫组化、原位杂交和RT-PCR结果
假手术组：MMP-2、MMP-3、TIMP-1和NF-κB
p65无或有少许表达。
对照组：MMP-2术后即刻表达，1周显著表达达高峰，2周后表达开始下降，4周后几乎无表达；MMP-3术后即刻表达，第2周表达最明显，4周以后表达很少；TIMP-1在术后表达逐渐增强，2周后达高峰，4周后表达仍较强；NF-κB
, 百拇医药
p65术后1周胞核中表达显著，胞浆中有轻微表达，以后表达下降。
通心络组：MMP-2、MMP-3、NF-κB p65术后各时间点表达均显著弱于同期对照组，而TIMP-1则明显强于对照组。
讨 论
血管新生内膜过度增生一直被认为是PTCA后再狭窄形成的主要原因，但针对抑制内膜增生的各种措施均不能有效预防再狭窄形成。目前，血管重构在再狭窄发生中的作用日益受到重视，甚至被认为起着比内膜增生更重要的作用。
本实验结果显示，家兔血管内膜损伤后第1周内膜增生显著，管腔狭窄，但IEL并无明显缩小，说明内膜损伤后早期血管狭窄主要由内膜增生所致；第2～6周，在内膜增生的同时，有大量细胞外基质形成并重新分布，血管回缩，IEL缩小，管腔面积进一步减少，说明损伤后晚期血管狭窄是内膜增生和血管重构的共同结果。
, 百拇医药
一般认为血管重构的发生机制是，PTCA后早期受损血管局部血流加速，剪切应力增强，造成局部血管代偿性增粗，继之发生血管慢性回缩；加上血管壁原有细胞外基质降解，及新的细胞外基质大量产生和重新分布，致使血管局部的几何构型发生改变，从而导致血管重构，产生血管狭窄。
通心络能改善内皮功能和抑制血管内膜增生，具有良好的扩张血管、改善心肌血供、缓解心绞痛以及降脂等作用。本研究结果显示，通心络在显著抑制受损血管内膜增生的同时，还明显抑制血管细胞外基质的合成与再分布，阻止损伤后期血管慢性回缩，防止IEL减少和管腔狭窄，提示通心络有明显抑制受损血管重构的作用。
MMPs是关系细胞外基质和胶原稳定的重要酶类，通常与特异性组织抑制因子TIMPs处于动态平衡状态，共同维持胶原和细胞外基质的正常结构和功能。当血管内膜损伤后，异常分泌的细胞因子和生长因子促使VSMC增生、迁移，细胞外基质异常分泌和沉积，产生大量MMPs等降解酶类，引起细胞外基质降解和重新分布，共同导致血管内膜过度增生和血管重构，造成血管狭窄。NF-κB是存在于细胞浆中的一种快速反应基因转录启动因子，可调节细胞因子、生长因子和MMPs等多种因子的表达，在调控免疫应答、炎症反应和细胞生长等方面发挥重要作用。通心络在抑制内膜增生和血管重构的同时，能调控MMP-2、MMP-3、TIMPs和 NF-κB p65表达，提示通心络的上述作用可能与调节MMPs/TIMPs平衡及抑制NF-κB表达与活化有关。, 百拇医药(山东省立医院心内科 病理科 朱兴雷 唐元升 刘莹 耿庆信 许法运 罗静 张兴华 摘要目的 探讨通心络)