溃疡性结肠炎动物模型的建立方法
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药学之窗
溃疡性结肠炎的病因复杂，迄今尚无定论。动物模型的建立对疾病、病因、病变发展规律，确定诊断及治疗的手段以及新药开发与研究等有重要意义。目前国内外对溃疡性结肠炎动物模型已进行了一些研究，取得了较大进展，就目前的国内外文献报道对溃疡性结肠炎动物模型的建立方法基本上可分为二类， 一类是运用免疫学的方法，另一类为物理刺激的方法，有关用免疫学方法来制造的溃疡性结肠炎动物模型已有不少，但综合起来不外乎同种异体组织及异种异体组织致敏及采用一些致敏性的化学物质致敏的方法，最常用的动物有大鼠、豚鼠及家兔，而用物理刺激的方法最常用的为豚鼠。本文就溃疡性结肠炎动物模型的建立方法及观察指标进行介绍。
1 免疫法
采用免疫法制作动物模型时，大鼠的种系、年龄与机体的免疫状态可影响发病率，对年幼(日龄<21 d)或年老(月龄)> 9 个月)的大鼠不易诱发溃疡性结肠炎。
1.1 同种异体或异种异体结肠粘膜组织致敏[1～4]
, 百拇医药
选用体重在 250～400 g 的大鼠，取大鼠结肠粘膜或人体手术后新鲜的结肠粘膜或其它动物的结肠粘膜组织，制成匀浆，加 Frend's 佐剂后，每鼠足垫内注射0.1～0.3 mL，间隔 14 d，再注射 1 次，28 d后随机取动物解剖观察模型是否成立，如不典型，可再注射 1 次至产生典型模型。
本模型制作的技术关键在于 Freund's 佐剂的制备，尤其是结核菌的研碎与乳化。
1.2 胎鼠结肠种植法[5～9]
成年大白鼠，体重 250～400 g，用戊巴比妥钠腹腔麻醉(80 mg/kg)。另取孕鼠 3 只，处死，取出胎鼠结肠 3～4 cm 长，用无菌手术包埋在成年大鼠右肾包膜下，术后正常饲养，第 7 日后解剖动物可见结肠炎性反应，第 14 日后病变加重，第 21 日解剖可见有典型溃疡性结肠炎形成。
值得注意的是，在手术操作时，应在无菌环境下操作，尽可能避免手术感染引起的动物死亡。
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1.3 大鼠结肠细菌菌株法[10]
取一只健康大鼠的结肠内容物，划线于伊红-美蓝平板，37℃ 培养 24 h，取典型菌落扩增，并作数值鉴定，确定为大肠杆菌后，冰箱保存备用。免疫前先取菌种扩增后，再用福尔马林杀死细菌，用生理盐水洗 2 次并将浓度调为 1.2×108/mL，在大鼠足跖处注射细菌悬液 0.2 mL，于第 10、17、24 天分别多点皮下注射 0.4 mL、0.6 mL和 1.2 mL，动物在第 2 次免疫前给予灌服相同浓度的活菌 1.5 ml，开始免疫后第 2 周即可见溃疡性结肠炎的临床症状，并逐渐严重，第 31 天后可见典型溃疡性结肠炎症状出现，组织病理学检查符合溃疡性结肠炎条件。
用以上 3 种方法制作的溃疡性结肠炎动物模型，需要的实验周期较长，产生的症状与临床较相似但症状相对较轻且多为慢性炎症，此模型较适用于抗溃疡性结肠炎新药的筛选。
1.4 致敏性化学物质致敏[11～12]
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用致敏性化学物质进行致敏产生的溃疡性结肠炎，其病变较其它免疫方法产生的病变更为严重，可用于疗效明确的抗溃疡性结肠炎作用强度的比较。
1.4.1 二硝基氯苯
取雄性豚鼠，体重在 350～400 g，将豚鼠颈背部毛剪去，涂擦二硝基氯苯(DNCB)Ⅰ液(DNCB 0.4 g:丙酮 1 mL) 约 1 cm2 大小，电吹风吹干，2 周后在豚鼠腹部再 1 次涂擦Ⅱ液(DNCB 0.2 g：丙酮 1 mL)，如果 2 d 后腹部出现红肿、硬结，说明豚鼠已对 DNCB 致敏，此时经肛门肠管内插管 6 cm 左右，注入 DNCBⅢ液(DNCB 0.2 g：丙酮 1 mL) 0.5 mL，2 日后即产生典型的急性溃疡性结肠炎模型，第 5 周后为慢性溃疡性结肠炎模型。
1.4.2 福尔马林
采用 Kirsner 免疫法[13]，用结晶卵蛋白对家兔隔日腹腔注射进行免疫，在皮试 Arthus 反应阳性时，对家兔进行单只喂养并用 1% 或 2% 的福尔马林溶液 1～2 mL 进行灌肠和用 2% 结晶卵蛋白 1.5 mL 缓慢 ip。第 5～6 天后处死解剖，从肛门齿状线始作结肠大体标本观察，可见溃疡性结肠炎模型成立。
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2 物理刺激法
应用化学介质直接接触动物直肠或结肠，使接触部位产生炎性病灶，多为急性模型。采用本法制作的优势在于模型制作需要的时间短，症状明显。
2.1 角叉菜胶刺激法[14]
取体重在 550 g 左右的豚鼠，在豚鼠腹部造一个胃瘘管，前两天连续从胃瘘管注入水，接着通过胃瘘管给予 5% 浓度的角叉菜胶溶液，连续 5 d，5 d 后取动物处死，解剖后可见有典型溃疡形成。
2.2 冰醋酸刺激法[15～17]
取豚鼠 350～450 g，♂♀兼用，禁食 24 h 后，以 2% 戊巴比妥钠溶液作腹腔麻醉(30 mg/kg)，0.5% 肥皂水灌肠。制备 0.3×0.3 cm2棉花纸浸沾 10% 冰醋酸(或用 5% 冰醋酸 0.2～0.3 mL 直接直肠注入)通过细橡皮管道送入距肛门 5～6 cm 处，间隔 2 天重复进行一次(如用直接注入冰醋酸的方法，1 次即可)，连续 3 次，于第 8 天处死动物，取出结肠和直肠观察，可见溃疡形成。
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在本模型的制作过程中，利用冰醋酸的酸性刺激引发结肠炎症，所以用于灌肠的肥皂水浓度不能大于 0.5%，否则由肥皂水引起的肠道内碱性环境，将影响造模效果。
3 结语
溃疡性结肠炎在欧美国家较多见，但近年我国报道的临床病例亦在不断增加[18]。从病理学上观察表现为粘膜层毛细血管扩张，充血，水肿，有大量淋巴细胞、浆细胞、单核细胞和中性白细胞浸润，并可见数量不等的嗜酸性白细胞及点状出血点，粘膜腺上皮细胞间有中性白细胞浸润，腺体呈现环状细胞减少或消失，而出现许多核较大、核仁明显、胞浆弱嗜碱并缺乏粘液分泌的柱状或立方形细胞，有隐窝脓肿和溃疡形成，有时腺管旁可见成堆的中性白细胞聚积而形成隐窝旁脓肿。确定溃疡性结肠炎动物模型成立与否，主要取决于上述组织病理学的改变。另外，模型动物的肠重指数(肠重/体重×100%)、水肿面积、出血点数量均为判断指标。
溃疡性结肠炎动物模型的建立，不仅为研究疾病发展规律提供依据，还为开发、研究抗溃疡性结肠炎的新药提供合适的研究条件。目前的研究发现传统的抗溃疡性结肠炎的药物柳氮磺吡啶及新药奥柳氮对上述动物模型均有显著的治疗作用，这与用于临床的治疗效果基本一致[19～21]。, http://www.100md.com
1 免疫法
采用免疫法制作动物模型时，大鼠的种系、年龄与机体的免疫状态可影响发病率，对年幼(日龄<21 d)或年老(月龄)> 9 个月)的大鼠不易诱发溃疡性结肠炎。
1.1 同种异体或异种异体结肠粘膜组织致敏[1～4]
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选用体重在 250～400 g 的大鼠，取大鼠结肠粘膜或人体手术后新鲜的结肠粘膜或其它动物的结肠粘膜组织，制成匀浆，加 Frend's 佐剂后，每鼠足垫内注射0.1～0.3 mL，间隔 14 d，再注射 1 次，28 d后随机取动物解剖观察模型是否成立，如不典型，可再注射 1 次至产生典型模型。
本模型制作的技术关键在于 Freund's 佐剂的制备，尤其是结核菌的研碎与乳化。
1.2 胎鼠结肠种植法[5～9]
成年大白鼠，体重 250～400 g，用戊巴比妥钠腹腔麻醉(80 mg/kg)。另取孕鼠 3 只，处死，取出胎鼠结肠 3～4 cm 长，用无菌手术包埋在成年大鼠右肾包膜下，术后正常饲养，第 7 日后解剖动物可见结肠炎性反应，第 14 日后病变加重，第 21 日解剖可见有典型溃疡性结肠炎形成。
值得注意的是，在手术操作时，应在无菌环境下操作，尽可能避免手术感染引起的动物死亡。
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1.3 大鼠结肠细菌菌株法[10]
取一只健康大鼠的结肠内容物，划线于伊红-美蓝平板，37℃ 培养 24 h，取典型菌落扩增，并作数值鉴定，确定为大肠杆菌后，冰箱保存备用。免疫前先取菌种扩增后，再用福尔马林杀死细菌，用生理盐水洗 2 次并将浓度调为 1.2×108/mL，在大鼠足跖处注射细菌悬液 0.2 mL，于第 10、17、24 天分别多点皮下注射 0.4 mL、0.6 mL和 1.2 mL，动物在第 2 次免疫前给予灌服相同浓度的活菌 1.5 ml，开始免疫后第 2 周即可见溃疡性结肠炎的临床症状，并逐渐严重，第 31 天后可见典型溃疡性结肠炎症状出现，组织病理学检查符合溃疡性结肠炎条件。
用以上 3 种方法制作的溃疡性结肠炎动物模型，需要的实验周期较长，产生的症状与临床较相似但症状相对较轻且多为慢性炎症，此模型较适用于抗溃疡性结肠炎新药的筛选。
1.4 致敏性化学物质致敏[11～12]
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用致敏性化学物质进行致敏产生的溃疡性结肠炎，其病变较其它免疫方法产生的病变更为严重，可用于疗效明确的抗溃疡性结肠炎作用强度的比较。
1.4.1 二硝基氯苯
取雄性豚鼠，体重在 350～400 g，将豚鼠颈背部毛剪去，涂擦二硝基氯苯(DNCB)Ⅰ液(DNCB 0.4 g:丙酮 1 mL) 约 1 cm2 大小，电吹风吹干，2 周后在豚鼠腹部再 1 次涂擦Ⅱ液(DNCB 0.2 g：丙酮 1 mL)，如果 2 d 后腹部出现红肿、硬结，说明豚鼠已对 DNCB 致敏，此时经肛门肠管内插管 6 cm 左右，注入 DNCBⅢ液(DNCB 0.2 g：丙酮 1 mL) 0.5 mL，2 日后即产生典型的急性溃疡性结肠炎模型，第 5 周后为慢性溃疡性结肠炎模型。
1.4.2 福尔马林
采用 Kirsner 免疫法[13]，用结晶卵蛋白对家兔隔日腹腔注射进行免疫，在皮试 Arthus 反应阳性时，对家兔进行单只喂养并用 1% 或 2% 的福尔马林溶液 1～2 mL 进行灌肠和用 2% 结晶卵蛋白 1.5 mL 缓慢 ip。第 5～6 天后处死解剖，从肛门齿状线始作结肠大体标本观察，可见溃疡性结肠炎模型成立。
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2 物理刺激法
应用化学介质直接接触动物直肠或结肠，使接触部位产生炎性病灶，多为急性模型。采用本法制作的优势在于模型制作需要的时间短，症状明显。
2.1 角叉菜胶刺激法[14]
取体重在 550 g 左右的豚鼠，在豚鼠腹部造一个胃瘘管，前两天连续从胃瘘管注入水，接着通过胃瘘管给予 5% 浓度的角叉菜胶溶液，连续 5 d，5 d 后取动物处死，解剖后可见有典型溃疡形成。
2.2 冰醋酸刺激法[15～17]
取豚鼠 350～450 g，♂♀兼用，禁食 24 h 后，以 2% 戊巴比妥钠溶液作腹腔麻醉(30 mg/kg)，0.5% 肥皂水灌肠。制备 0.3×0.3 cm2棉花纸浸沾 10% 冰醋酸(或用 5% 冰醋酸 0.2～0.3 mL 直接直肠注入)通过细橡皮管道送入距肛门 5～6 cm 处，间隔 2 天重复进行一次(如用直接注入冰醋酸的方法，1 次即可)，连续 3 次，于第 8 天处死动物，取出结肠和直肠观察，可见溃疡形成。
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在本模型的制作过程中，利用冰醋酸的酸性刺激引发结肠炎症，所以用于灌肠的肥皂水浓度不能大于 0.5%，否则由肥皂水引起的肠道内碱性环境，将影响造模效果。
3 结语
溃疡性结肠炎在欧美国家较多见，但近年我国报道的临床病例亦在不断增加[18]。从病理学上观察表现为粘膜层毛细血管扩张，充血，水肿，有大量淋巴细胞、浆细胞、单核细胞和中性白细胞浸润，并可见数量不等的嗜酸性白细胞及点状出血点，粘膜腺上皮细胞间有中性白细胞浸润，腺体呈现环状细胞减少或消失，而出现许多核较大、核仁明显、胞浆弱嗜碱并缺乏粘液分泌的柱状或立方形细胞，有隐窝脓肿和溃疡形成，有时腺管旁可见成堆的中性白细胞聚积而形成隐窝旁脓肿。确定溃疡性结肠炎动物模型成立与否，主要取决于上述组织病理学的改变。另外，模型动物的肠重指数(肠重/体重×100%)、水肿面积、出血点数量均为判断指标。
溃疡性结肠炎动物模型的建立，不仅为研究疾病发展规律提供依据，还为开发、研究抗溃疡性结肠炎的新药提供合适的研究条件。目前的研究发现传统的抗溃疡性结肠炎的药物柳氮磺吡啶及新药奥柳氮对上述动物模型均有显著的治疗作用，这与用于临床的治疗效果基本一致[19～21]。, http://www.100md.com