络病与心脑血管疾病相关性及治疗研究进展 通心络对大鼠脑缺血再灌注损伤的治疗和保护机制的研究(续)
预防组大鼠梗死侧皮层匀浆MDA、NO含量明显低于未用药对照组，治疗组在缺血再灌注后第5天MDA含量较对照组降低，差异显著(表4)。
表4. 通心络对MDA和NO含量的影响
1h
1d
5d
对照组(MDA)
6.4±0.75
7.1±0.78
12.9±2.1
治疗组(MDA)
, http://www.100md.com 5±0.69
5±0.72
5.4±0.92*
预防组(MDA)
1.4±0.82*
4.6±0.69
5.1±0.88*
对照组(NO)
2.5±0.19
3.1±0.21
5±0.24
治疗组(NO)
, 百拇医药
2.43±0.21
2.98±0.20
4.6±0.19*
预防组(NO)
2.45±0.28
2.7±0.17*
4.48±0.15*
*与对照组比较
P<0.05
通心络对大鼠梗死侧皮层匀浆Na+-K+-ATP酶活性的影响：大鼠缺血2h再灌注后1h和1d，预防组和治疗组大鼠梗死侧皮层匀浆Na+-K+-ATP酶活性明显高于未用药对照组，差异具有统计学意义，但缺血再灌注后第5天两组与对照组比较无明显差异(表5)。
, http://www.100md.com
表5. 通心络对Na+-K+-ATP酶活性的影响
1h
1d
5d
对照组
0.25±0.04
0.19±0.03
0.16±0.01
治疗组
0.45±0.02*
0.27±0.01*
0.19±0.03
, 百拇医药
预防组
0.43±0.01*
0.25±0.02
0.2±0.02
*与对照组比较
P<0.05
细胞凋亡检测
透射电镜观察海马神经元凋亡情况
对照组可见海马神经元以中晚期细胞凋亡及凋亡小体为主，而通心络治疗组与预防组大多为早期凋亡。
通心络对caspase-3和c-fos基因表达的影响
, 百拇医药
治疗组和预防组caspase-3和c-fos的表达较对照组明显减少。
免疫荧光观察小胶质细胞表达
对照组的小胶质细胞表达活跃，与对照组比较，治疗组和预防组的小胶质细胞表达被抑制，红色荧光减少和减弱。
讨
论
缺血性脑血管病是一种高致残、高致死性的常见疾病，目前的治疗动向主要集中在急性期溶栓和神经保护剂两大方面。目前，神经保护剂的使用及其对缺血再灌注损伤的保护作用日益受到人们的重视。在神经组织中，神经元对缺血、缺氧、感染等尤为敏感，一旦受损后会造成较严重的损伤，出现凋亡或坏死，给患者造成较严重的神经功能缺损，因而成为迫切需要解决的问题。在各种治疗手段中，神经保护治疗是一个正在兴起的研究热点。通心络胶囊是吴以岭教授首创运用中医络病理论研制而成的中药复方制剂，具有益气活血、通络止痛、扩张血管及降低血脂等功效，用于治疗缺血性脑血管病具有一定的临床疗效。但其作用机制尚不十分清楚。本课题通过研究引起脑缺血损害的多条途径，探讨通心络对脑缺血损害的保护机制。
, 百拇医药
目前认为脑缺血损伤与缺血、缺氧造成自由基的产生、兴奋性氨基酸递质的迅速释放、乳酸堆积、细胞内钙离子超载有关，即自由基的连锁级连反应触发，进而导致细胞的坏死或凋亡。
当脑缺血再灌注时，机体抗氧化物防御功能紊乱，缺血脑组织产生过多的氧基团，去毒系统失活，抗氧化物质消耗，促发了缺血性脑损害的病变过程。因此，清除自由基或减少再灌注时氧基团的产生能保护脑组织免受再灌注损害。而SOD、GSH-PX是两种能有效清除体内单线态氧、超氧阴离子、羟自由基等多种自由基的抗氧化酶，能减轻缺血、缺氧时LPO的损伤。本研究结果显示随着缺血再灌注后时间的推移(从1小时到5天)，大鼠梗死侧MDA的含量呈进行性升高，同时自由基清除剂SOD的活性降低，提示氧自由基参与了缺血损伤机制。而腹腔注射通心络后，无论预防组还是治疗组，MDA含量均有下降，SOD活性增加，提示通心络通过清除自由基而达到对缺血神经元的保护作用。
缺血再灌注可造成钙稳态失衡，这一方面是由于钠平衡障碍所致，即缺血引起细胞膜Na+-K+泵功能障碍，从而使钠、水在细胞内潴留，细胞肿胀，然后又依Na+-Ca2+交换机制使细胞外钙大量内流，造成细胞钙超载。另一方面，再灌注时氧自由基的大量产生，引发细胞膜LPO，使膜受损，通透性增高，故在灌注时细胞外钙顺着浓度梯度而大量内流，使细胞内钙超载，细胞功能紊乱，出现细胞生物膜损害，线粒体肿胀，氧化磷酸化过程发生障碍，能量代谢受阻，导致神经元不可逆性死亡。本研究显示随着缺血损伤的加重，Na+-K+-ATP酶的活性降低，LPO含量增高，证实钙超载损伤形成的过程。本研究应用通心络后能减低LPO含量，增强Na+-K+-ATP酶活性，表明通心络能抑制钙内流，减轻钙超载，而达到减轻缺血再灌注损伤的作用。
, 百拇医药
在脑组织中，有比神经细胞更多的胶质细胞，如小胶质细胞、星型胶质细胞等。当脑缺血再灌注损伤发生时，会引发一系列细胞及分子变化，其中一重要现象就是胶质细胞活化，即反应性胶化过程。胶质细胞在缺血早期即被活化，释放大量的免疫介质、NO、氧自由基和其他毒性物质，有些物质可能直接具有神经毒性，或间接吸引各类炎性细胞，再次释放毒性物质，造成二度神经损伤。NO含量的增高与其唯一限速酶NOS的活性增加有关，NOS的不恰当激活和NO的过度产生可介导兴奋性氨基酸的毒性作用。NOS属于高度可调节的酶类，在其催化NO的底物L-精氨酸生成NO的过程中，可进行多部位、多层次的干预。我们的实验结果也显示在大鼠缺血2h再灌注后1小时，梗死侧海马区及皮层区可见较多量的小胶质细胞表达，同时伴有梗死侧大脑匀浆氧自由基、NOS和NO含量的升高，提示缺血再灌注早期小胶质细胞的活化及其释放氧自由基、NOS和NO所造成的神经毒性可能是缺血损伤发生的机制之一。在治疗组和预防组中小胶质细胞的表达极少量，提示通心络可能通过抑制缺血早期小胶质细胞的活化，抑制炎性介质、NO、NOS和氧自由基的释放，从而减少神经毒性物质的释放，达到神经保护的作用。
, 百拇医药
细胞凋亡是细胞为维持其内稳态，对内外环境刺激或死亡信号的触发，做出由基因控制的细胞自主性程序死亡。近来研究表明，脑卒中后缺血区周边的神经细胞逐渐死亡与凋亡相关。大鼠脑缺血后“半暗区”出现大量的凋亡细胞，其中半胱氨酸蛋白酶家族在促进神经元凋亡中起关键作用。正常情况下，Caspase-3存在于细胞浆内，长32Kda，无酶活性，称为caspase-3前体。在损伤作用下，线粒体膜上细胞色素C向胞浆释放，与Apaf-1形成复合体，降解Caspase-3前体，使之成为具有活性的酶，进而降解下游底物，使凋亡事件完成而不可逆转。有研究发现，缺血模型大鼠海马和壳核等处在脑缺血8h、24h后Caspase-3mRNA表达较正常组织增高。近来认为Caspase-3参与了脑缺血后神经元损伤的病理过程。本研究表明，随着缺血再灌注损伤时间的延长，Caspase-3的表达有所增加，可见凋亡程序参与了脑缺血损伤机制。腹腔注射通心络后能降低Caspase-3的表达，提示该药物可能具有抗凋亡作用。
C-fos作为原癌基因，也与神经细胞的凋亡有重要关系。c-fos基因表达可能是缺血致神经损伤的分子机制之一。脑缺血诱导C-fos基因在脑内快速而短暂地表达
其表达产物c-fos
mRNA和Fos被认为是对缺血反应的敏感标记。本研究还发现，通心络能下调缺血再灌注早期的c-fos基因表达，从而产生抗凋亡作用。因而通心络可能通过抑制Caspase蛋白酶级联反应(Caspase-3)及c-fos介导的凋亡途径来减少缺血神经元损伤，具有抗凋亡作用。同时，通心络还能降低脑组织的含水量，有抗水肿的作用，并能减少脑梗死的面积。
综上，本研究显示通心络可通过调节自由基、钙超载、炎症、凋亡等多个途径，达到减轻脑水肿，减轻大鼠缺血再灌注损伤和减小脑梗死面积的作用，通心络是治疗和预防缺血性卒中值得推荐的具有较好疗效的神经保护剂。参考文献(略), 百拇医药
表4. 通心络对MDA和NO含量的影响
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对照组(MDA)
6.4±0.75
7.1±0.78
12.9±2.1
治疗组(MDA)
, http://www.100md.com 5±0.69
5±0.72
5.4±0.92*
预防组(MDA)
1.4±0.82*
4.6±0.69
5.1±0.88*
对照组(NO)
2.5±0.19
3.1±0.21
5±0.24
治疗组(NO)
, 百拇医药
2.43±0.21
2.98±0.20
4.6±0.19*
预防组(NO)
2.45±0.28
2.7±0.17*
4.48±0.15*
*与对照组比较
P<0.05
通心络对大鼠梗死侧皮层匀浆Na+-K+-ATP酶活性的影响：大鼠缺血2h再灌注后1h和1d，预防组和治疗组大鼠梗死侧皮层匀浆Na+-K+-ATP酶活性明显高于未用药对照组，差异具有统计学意义，但缺血再灌注后第5天两组与对照组比较无明显差异(表5)。
, http://www.100md.com
表5. 通心络对Na+-K+-ATP酶活性的影响
1h
1d
5d
对照组
0.25±0.04
0.19±0.03
0.16±0.01
治疗组
0.45±0.02*
0.27±0.01*
0.19±0.03
, 百拇医药
预防组
0.43±0.01*
0.25±0.02
0.2±0.02
*与对照组比较
P<0.05
细胞凋亡检测
透射电镜观察海马神经元凋亡情况
对照组可见海马神经元以中晚期细胞凋亡及凋亡小体为主，而通心络治疗组与预防组大多为早期凋亡。
通心络对caspase-3和c-fos基因表达的影响
, 百拇医药
治疗组和预防组caspase-3和c-fos的表达较对照组明显减少。
免疫荧光观察小胶质细胞表达
对照组的小胶质细胞表达活跃，与对照组比较，治疗组和预防组的小胶质细胞表达被抑制，红色荧光减少和减弱。
讨
论
缺血性脑血管病是一种高致残、高致死性的常见疾病，目前的治疗动向主要集中在急性期溶栓和神经保护剂两大方面。目前，神经保护剂的使用及其对缺血再灌注损伤的保护作用日益受到人们的重视。在神经组织中，神经元对缺血、缺氧、感染等尤为敏感，一旦受损后会造成较严重的损伤，出现凋亡或坏死，给患者造成较严重的神经功能缺损，因而成为迫切需要解决的问题。在各种治疗手段中，神经保护治疗是一个正在兴起的研究热点。通心络胶囊是吴以岭教授首创运用中医络病理论研制而成的中药复方制剂，具有益气活血、通络止痛、扩张血管及降低血脂等功效，用于治疗缺血性脑血管病具有一定的临床疗效。但其作用机制尚不十分清楚。本课题通过研究引起脑缺血损害的多条途径，探讨通心络对脑缺血损害的保护机制。
, 百拇医药
目前认为脑缺血损伤与缺血、缺氧造成自由基的产生、兴奋性氨基酸递质的迅速释放、乳酸堆积、细胞内钙离子超载有关，即自由基的连锁级连反应触发，进而导致细胞的坏死或凋亡。
当脑缺血再灌注时，机体抗氧化物防御功能紊乱，缺血脑组织产生过多的氧基团，去毒系统失活，抗氧化物质消耗，促发了缺血性脑损害的病变过程。因此，清除自由基或减少再灌注时氧基团的产生能保护脑组织免受再灌注损害。而SOD、GSH-PX是两种能有效清除体内单线态氧、超氧阴离子、羟自由基等多种自由基的抗氧化酶，能减轻缺血、缺氧时LPO的损伤。本研究结果显示随着缺血再灌注后时间的推移(从1小时到5天)，大鼠梗死侧MDA的含量呈进行性升高，同时自由基清除剂SOD的活性降低，提示氧自由基参与了缺血损伤机制。而腹腔注射通心络后，无论预防组还是治疗组，MDA含量均有下降，SOD活性增加，提示通心络通过清除自由基而达到对缺血神经元的保护作用。
缺血再灌注可造成钙稳态失衡，这一方面是由于钠平衡障碍所致，即缺血引起细胞膜Na+-K+泵功能障碍，从而使钠、水在细胞内潴留，细胞肿胀，然后又依Na+-Ca2+交换机制使细胞外钙大量内流，造成细胞钙超载。另一方面，再灌注时氧自由基的大量产生，引发细胞膜LPO，使膜受损，通透性增高，故在灌注时细胞外钙顺着浓度梯度而大量内流，使细胞内钙超载，细胞功能紊乱，出现细胞生物膜损害，线粒体肿胀，氧化磷酸化过程发生障碍，能量代谢受阻，导致神经元不可逆性死亡。本研究显示随着缺血损伤的加重，Na+-K+-ATP酶的活性降低，LPO含量增高，证实钙超载损伤形成的过程。本研究应用通心络后能减低LPO含量，增强Na+-K+-ATP酶活性，表明通心络能抑制钙内流，减轻钙超载，而达到减轻缺血再灌注损伤的作用。
, 百拇医药
在脑组织中，有比神经细胞更多的胶质细胞，如小胶质细胞、星型胶质细胞等。当脑缺血再灌注损伤发生时，会引发一系列细胞及分子变化，其中一重要现象就是胶质细胞活化，即反应性胶化过程。胶质细胞在缺血早期即被活化，释放大量的免疫介质、NO、氧自由基和其他毒性物质，有些物质可能直接具有神经毒性，或间接吸引各类炎性细胞，再次释放毒性物质，造成二度神经损伤。NO含量的增高与其唯一限速酶NOS的活性增加有关，NOS的不恰当激活和NO的过度产生可介导兴奋性氨基酸的毒性作用。NOS属于高度可调节的酶类，在其催化NO的底物L-精氨酸生成NO的过程中，可进行多部位、多层次的干预。我们的实验结果也显示在大鼠缺血2h再灌注后1小时，梗死侧海马区及皮层区可见较多量的小胶质细胞表达，同时伴有梗死侧大脑匀浆氧自由基、NOS和NO含量的升高，提示缺血再灌注早期小胶质细胞的活化及其释放氧自由基、NOS和NO所造成的神经毒性可能是缺血损伤发生的机制之一。在治疗组和预防组中小胶质细胞的表达极少量，提示通心络可能通过抑制缺血早期小胶质细胞的活化，抑制炎性介质、NO、NOS和氧自由基的释放，从而减少神经毒性物质的释放，达到神经保护的作用。
, 百拇医药
细胞凋亡是细胞为维持其内稳态，对内外环境刺激或死亡信号的触发，做出由基因控制的细胞自主性程序死亡。近来研究表明，脑卒中后缺血区周边的神经细胞逐渐死亡与凋亡相关。大鼠脑缺血后“半暗区”出现大量的凋亡细胞，其中半胱氨酸蛋白酶家族在促进神经元凋亡中起关键作用。正常情况下，Caspase-3存在于细胞浆内，长32Kda，无酶活性，称为caspase-3前体。在损伤作用下，线粒体膜上细胞色素C向胞浆释放，与Apaf-1形成复合体，降解Caspase-3前体，使之成为具有活性的酶，进而降解下游底物，使凋亡事件完成而不可逆转。有研究发现，缺血模型大鼠海马和壳核等处在脑缺血8h、24h后Caspase-3mRNA表达较正常组织增高。近来认为Caspase-3参与了脑缺血后神经元损伤的病理过程。本研究表明，随着缺血再灌注损伤时间的延长，Caspase-3的表达有所增加，可见凋亡程序参与了脑缺血损伤机制。腹腔注射通心络后能降低Caspase-3的表达，提示该药物可能具有抗凋亡作用。
C-fos作为原癌基因，也与神经细胞的凋亡有重要关系。c-fos基因表达可能是缺血致神经损伤的分子机制之一。脑缺血诱导C-fos基因在脑内快速而短暂地表达
其表达产物c-fos
mRNA和Fos被认为是对缺血反应的敏感标记。本研究还发现，通心络能下调缺血再灌注早期的c-fos基因表达，从而产生抗凋亡作用。因而通心络可能通过抑制Caspase蛋白酶级联反应(Caspase-3)及c-fos介导的凋亡途径来减少缺血神经元损伤，具有抗凋亡作用。同时，通心络还能降低脑组织的含水量，有抗水肿的作用，并能减少脑梗死的面积。
综上，本研究显示通心络可通过调节自由基、钙超载、炎症、凋亡等多个途径，达到减轻脑水肿，减轻大鼠缺血再灌注损伤和减小脑梗死面积的作用，通心络是治疗和预防缺血性卒中值得推荐的具有较好疗效的神经保护剂。参考文献(略), 百拇医药